2. Proliferasi Limfosit a Persiapan Media Kultur Sel
Media yang dipergunakan untuk kultur sel limfosit adalah RPMI-1640 yang mengandung L-glutamine. Sebanyak 10.42 gram bubuk RPMI dilarutkan
dalam aquabidest sebanyak 1 liter sehingga diperoleh 1 liter larutan RPMI- 1640. Lalu larutan tersebut ditambahkan 2 gram NaHCO
3
yang berfungsi sebagai buffer dan 10 ml gentamycin untuk mencegah pertumbuhan
mikroorganisme pada media. Campuran larutan tersebut kemudian dilewatkan pada membran steril 0.22 µm hingga menjadi steril.
b Limfosit Darah Tepi Nurrahman et al., 1999
Darah dari donor yang sehat diambil secara aseptis di klinik Farfa, Dramaga, Bogor oleh seorang dokter menggunakan vacutainer darah steril.
Darah tersebut kemudian dipindahkan ke dalam tabung sentrifus, pemindahan darah ini dilakukan di dalam laminar hood untuk menjamin kesterilan proses.
Pemisahan limfosit awal dilakukan dengan sentrifuse darah selama 10 menit pada 1500 rpm. Darah akan terpisah menjadi tiga bagian, yaitu sel darah merah
pada bagian bawah, lapisan buffycoat pada bagian tengah, dan plasma pada bagian atas. Lapisan buffycoat adalah bagian darah yang sebagian besar berisi
sel-sel limfosit. Lapisan buffycoat ini diambil dengan menggunakan mikropipet dan dilakukan pemisahan sel limfosit dengan menggunakan Histopaque
buffycoat:Histopaque = 1:1. Lapisan buffycoat dilewatkan secara hati-hati di atas Histopaque melalui dinding tabung sehingga terbentuk dua lapisan yang
tidak bercampur kemudian dilakukan sentrifuse 2500 rpm selama 30 menit. Sel- sel limfosit, monosit dan platelet tidak mempunyai densitas yang cukup tinggi
untuk menembus Histopaque sehingga berada di bagian atas, sedangkan granulosit berada di dasar tabung. Proses isolasi sel limfosit yang dilakukan
dapat dilihat pada Gambar 7.
Gambar
Setelah sebanyak 5 ml
dilakukan dua dan Histopaque.
c Serum Darah
Darah klinik Farfa, Dramaga,
darah steril lalu dilakukan di dalam
tersebut kemudian menjadi tiga bagian.
mikropipet dan dipisahkan lalu
disterilkan menggunakan μ
a b
Gambar 7. a Darah setelah disentrifuse dan terpisah
plasma, buffycoat, dan eritrosit , b Lapisan buffycoat dan larutan Histopaque
c Setelah disentrifuse, terjadi pemisahan histopaque, dan limfosit.
Setelah dipisahkan, ditambahkan dengan media ml lalu disentrifuse selama 10 menit pada 1000
kali, sehinggga limfosit terpisah dari platelet, Histopaque.
Darah AB Nurrahman et al., 1999
Darah dari donor bergolongan AB yang sehat diambil Dramaga, Bogor oleh seorang dokter menggunakan
lalu dipindahkan ke dalam tabung sentrifus . Pemindahan dalam laminar hood untuk menjamin kesterilan
kemudian disentrifuse selama 30 menit pada 2500 rpm bagian. Bagian yang berada di bagian atas diambil
dan bagian darah tidak boleh sampai terambil. lalu dipanaskan dalam waterbath suhu 56
˚C selama menggunakan membran steril 0.20
μm.
c
terpisah menjadi bagian Histopaque ,
pemisahan eritrosit,
media RPMI standar 1000 rpm. Pencucian
platelet, monosit, plasma,
diambil secara aseptis di menggunakan vacutainer
emindahan darah ini sterilan proses. Darah
rpm hingga terpisah diambil menggunakan
bil. Bagian yang sudah ˚ selama 30 menit lalu
d Pengujian Aktivitas Proliferasi dengan metode MTT Meiriana, 2006
Suspensi sel limfosit dihitung menggunakan haemacytometer dengan pewarnaan biru tripan dan ditepatkan jumlahnya menjadi 2 x 10
6
sel ml lalu ditambahkan serum golongan darah AB sebanyak 10 dari volume akhir
suspensi sel. Mula-mula ekstrak sampel dimasukkan pada masing-masing sumur pada lempeng sumur sebanyak 20 µl dan ditambahkan suspensi sel
sebanyak 80 µl. Untuk kontrol standar, sumur hanya berisi RPMI dan sel, sedangkan kontrol positif, ditambahkan larutan mitogen yaitu lipopolisakarida
bakteri Salmonella sp. dan pokeweed masing-masing sebanyak 20 µl. Kultur kemudian diinkubasi pada suhu 37
C dengan atmosfer 5 CO
2,
O
2
95 dan RH 96 selama 72 jam. Enam jam sebelum masa inkubasi berakhir, kultur
ditambahkan dengan 10 µl larutan MTT 0.5 yang dilarutkan dalam aquades. Setelah masa inkubasi berakhir, sebanyak 100 µl HCl-isopropanol
0.04N ditambahkan pada setiap sumur. Kemudian absorbansi masing-masing sumur diukur menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 570 nm.
Pada penelitian ini, dilakukan pembacaan nilai absorbansi kultur dari tiga batch yang berbeda dengan masing-masing batch memiliki tiga ulangan. Nilai OD
hasil pembacaan menggunakan ELISA reader bersifat proporsional terhadap jumlah sel yang hidup. Penampakan kultur sel setelah inkubasi dan
penambahan larutan pereaksi dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar
Pengujian persamaan berikut:
I.S. = Abs
3. Kadar Malonaldehida
Kategori