lebih dahulu. Pelebaran pita tidak tergantung dari kecepatan alir yang digunakan dan hanya bergantung dari penyusunan dan ukuran partikel dalam kolom.
Pelebaran pita yang diakibatkan karena difusi Eddy akan semakin besar seiring dengan peningkatan ukuran partikel kolom Snyder et al., 2010.
Transfer massa dapat menyebabkan pelebaran pita, terjadinya transfer massa disebabkan oleh transfer massa fase gerak yang merupakan kecepatan alir
analit yang mempengaruhi pelebaran pita, diantara partikel fase diam terdapat rongga bilamana analit melewatinya akan lebih cepat keluar terbaca detektor dan
bila analit cenderung lebih menyamping maka akan terjadi interaksi dahulu terhadap partikel fase diam. Transfer massa fase diam menggambarkan analit
yang terpenetrasi ke dalam partikel fase diam dan tinggal lebih lama sebelum meninggalkan partikel fase diam. Perbedaan lama waktu tinggal dan adanya analit
yang terlebih dahulu terelusi keluar akan menyebabkan pelebaran pita Snyder et al., 2010.
3. Fase Diam
Kolom pada KCKT tidak memerlukan temperatur tinggi karena sifat ikatan kimia terhadap fase diam sangat sensitif terhadap temperatur tinggi.
pemilihan kolom berdasarkan jenis fase gerak dan sifat fisika kimia zat analit Snyder et al, 2010.
Sifat bahan pengisi atau fase diam dalam kolom bervariasi meskipun dari satu produk yang sama. Variasi fase diam yang banyak digunakan dapat
berdasarkan partikel yang porous atau non porous dengan ukuran diameter yang
kecil dan permukaan partikel kecil yang porous. Salah satu fase diam yang digunakan dalam instrumen KCKT adalah silika.
Silika adalah suatu adsorben dengan sifat yang terkenal dan banyak digunakan sebagai bahan isian kolom. Silika terdiri dari atom silikon yang
dijembatani secara tiga dimensi oleh atom oksigen. Silika mengandung gugus OH silanol sehingga permukaannya memungkinkan untuk dimodifikasi untuk
memberikan sifat yang spesifik. Modifikasi dari kolom silika sebagai bahan isian kolom telah sangat berkembang Munson, 1991.
Tabel I. Modifikasi silika pada kolom dan aplikasinya Munson, 1991
Kolom Fase
Aplikasi C18
Octadecyl Non-polar umum
C8 Octyl
Non-polar umum Phenyl
Styryl Asam lemak, ikatan rangkap
Cyano Cyanopropil
Keton, aldehide Diol
Aminopropil Sugar,anion
Amino Dihydroxylhexyl
Protein SAX Strong anion
exchanger Aromatic quaternaryamine
Anion
4. Fase Gerak
Pada pemilihan fase gerak yang perlu diperhatikan adalah fase gerak harus berinteraksi dengan fase diam yang sesuai untuk memisahkan suatu
campuran secepat dan seefisien mungkin. Secara umum pemilihan fase gerak
harus memenuhi kriteria viskositas, transparansi UV, titik didih, kemurnian, sifat inert, toksisitas dan harga Chan et al, 2004.
Viskositas yang rendah menghasilkan tekanan yang rendah dibanding suatu pelarut dengan viskositas yang lebih tinggi pada suatu aliran tertentu. Untuk
transparansi UV, jika serapan UV yang digunakan maka fase gerak yang digunakan haruslah transparan pada panjang gelombang yang digunakan Jeffrey,
1996. Pelarut yang digunakan dalam KCKT harus standar KCKT dan disaring
dengan ukuran pori 0,2 μm. Pelarut yang digunakan harus murni dan tidak mengandung gas untuk menghindari pembentukan gelembung gas ketika
melewati katub atau memasuki bejana piston. Suatu sistem degassing dibutuhkan untuk menghilangkan udara dalam larutan Christian, 1994. Adanya gas dalam
fase gerak akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis Gandjar dan Rohman, 2012.
Syarat-syarat fase gerak untuk KCKT adalah : murni, tanpa cemaran, tidak bereaksi dengan kemasan, sesuai dengan detektor, dapat melarutkan
cuplikan, mempunyai viskositas yang rendah, memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah, harganya wajar Gandjar dan Rohman, 2012.
Pemilihan fase gerak yang digunakan terutama berdasarkan indeks polaritas P’ campuran fase geark tersebut. Semakin besar nilai indeks polaritas
menyatakan semakin polar fase gerak yang digunakan. Fase gerak yang sering digunakan merupakan kombinasi dari dua atau lebih campuran pelarut yang saling
bercampur secara keseluruhan. Campuran fase gerak tersebut akan menghasilkan nilai polaritas tersendiri yang disebut indeks polaritas fase gerak Harvey, 2000.
P’
AB
=
A
. P’
A
+
B
. P’
B
Dengan
A
dan
B
merupakan fraksi volume pelarut yang digunakan pada pelarut A dan B, sedangkan P’
A
dan P’
B
merupakan indeks polaritas pelarut yang digunakan pada pelarut A dan B Harvey, 2000.
Untuk mengetahui nilai indeks polaritas dari fase gerak yang digunakan maka dapat dilihat dari tabel berikut.
Tabel II. Nilai indeks polaritas pelarut Snyder et al., 1997.
Pelarut Indeks
polaritas Eluotropic values
UV Cut off nm
Alumina C
18
Silika
Heksan 0,1
0,01 -
0,00 195
Sikloheksan 0,2
0,04 -
- 200
Toluen 2,4
0,29 -
0,22 284
Tetrahidrofuran 4,0
0,45 3,7
0,53 212
Etil asetat 4,4
0,58 -
0,48 256
Aseton 5,1
0,56 8.8
0,53 330
Metanol 5,1
0,95 1,0
0,70 205
Asetonitril 5,8
0,65 3,1
0,52 190
Air 10,2
- -
- 190
Deret elutropik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan suatu panduan yang berguna dalam memilih fase gerak yang akan digunakan
dalam sistem KCKT. Nilai UV cut off pemenggalan UV merupakan panjang gelombang dimana kuvet 1 cm yang digunakan pelarut akan memberikan absorbsi
lebih dari satu satuan absorbansi. Pentingnya mengetahui panjang gelombang pemenggalan UV sangat berguna saat menggunakan detektor UV, penggunaan
panjang gelombang deteksi dianjurkan tidak bertepatan atau di sekitar panjang gelombang pemenggalan UV dari pelarut yang digunakan sebagai fase gerak
Gandjar dan Rohman, 2010.
F. Validasi Metode
Validasi metode analisis adalah proses dimana suatu metode ditetapkan melalui serangkaian uji laboratorium bahawa karakter penampilan metode
tersebut memenuhi persyaratan untuk penerapan metode yang dimaksud. Tujuan akhir validasi metode adalah untuk menjamin bahwa tiap pengukuran di masa
yang akan datang dalam suatu analisis rutin harus cukup dekat dengan nilai kandungan analit sebenarnya yang terkandung dalam suatu sampel Gandjar dan
Rohman, 2012. Validasi metode menurut Association of Official Analytical Chemistry
AOAC adalah suatu proses yang menetapkan karakteristik suatu metode yang ditemukan dapat memenuhi kebutuhan untuk aplikasi analisis yang diharapkan
dengan cara studi laboratorium. Validasi dibagi menjadi empat kelas yaitu kelas A, B, C dan D. Kelas A digunakan untuk identifikasi senyawa. Kelas B digunakan
untuk mendeteksi dan menentukan pengotor. Kelas C dapat menentukan senyawa
