20
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena subjek uji diberi perlakuan.
B. Variabel
1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.
2. Variabel tergantung berupa aktivitas antioksidan dan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.
3. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu pemanenan dan cara panen.
4. Variabel pengacau tidak terkendali berupa cahaya matahari, cuaca, kelembaban, curah hujan.
C. Definisi Operasional
1. Daun dadap serep adalah daun folium segar dari tanaman dadap serep yang dipanen dari Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma Yogyakarta dengan bentuk daun belah ketupat, dengan lebar ± 10-17 cm, berwarna hijau.
2. Ekstrak etanolik daun dadap serep adalah sari hasil proses maserasi daun dadap serep dengan penyari etanol.
3. Fraksi etil asetat adalah hasil fraksinasi ekstrak etanolik daun dadap serep dengan menggunakan pelarut etil asetat.
4. Persen inhibition concentration IC adalah persen yang menyatakan kemampuan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep untuk
menangkap radikal DPPH. 5. Nilai inhibition concentration 50 IC50 adalah nilai konsentrasi fraksi etil
asetat ekstrak etanolik daun dadap serep yang menghasilkan penangkapan 50 radikal DPPH.
D. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: daun dadap serep yang diambil dari kebun tanaman obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma Yogyakarta, akuades Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma; bahan kualitas p.a. E. Merck,
yaitu: metanol, bahan kualitas p.a. Sigma Chem. Co., USA, yaitu: DPPH, reagen Folin-Ciocalteu, asam galat, dan kuersetin kualitas Sigma Chem. Co., USA; bahan
kualitas teknis Brataco Chemica, yaitu: wasbensin dan etil asetat; bahan kualitas teknis CV. General Labora, yaitu: metanol; dan aluminium foil.
2. Alat penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: neraca analitik Scaltec SBC 22, BP 160P, vacuum rotary evaporator Junke Kunkel, waterbath
labo-tech, Heraeus, vortex Janke Kunkel, spektrofotometer UV-Vis Perkin Elmer Lamda 20, blender, corong Buchner, oven, mikropipet 10-
1000 L; 1-10 mL Acura 825, Socorex, tabung reaksi bertutup, dan alat-alat gelas yang lazim
digunakan di laboratorium analisis Pyrex-Germany dan Iwaki.
E. Tatacara Penelitian 1. Determinasi tumbuhan
Determinasi tanaman dadap serep dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimian, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta.
2. Pengumpulan bahan
Tanaman dadap serep diperoleh dari kebun tanaman obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma di Yogyakarta. Pengumpulan pada musim
kemarau bulan Agustus tahun 2012. Pemanenan dilakukan pada tanaman saat pagi hari.
3. Preparasi sampel
Daun dadap serep segar dicuci dengan air mengalir, dikering-anginkan, dan ditimbang sebanyak 1 kg, kemudian dihaluskan dengan grinder. Ketika
dihaluskan, daun tersebut ditambahkan sedikit cairan penyari etanol 76. Simplisia yang telah dihaluskan ditimbang 100 g dan dituang kedalam bejana
maserasi, ditambah etanol 76 sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama dua hari. Filtrat
diperoleh melalui penyaringan dengan corong Buchner. Ampas penyaringan diremaserasi dengan etanol 76 secukupnya selama dua hari. Kemudian filtratnya
dicampurkan dengan filtrat terdahulu. Campuran filtrat kemudian disaring. Lalu hasil penyaringan filtrat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator
hingga diperoleh ekstrak etanol daun dadap serep.
Ekstrak etanol daun dadap serep ditambah 300 mL air hangat dan diekstraksi cair-cair menggunakan wasbensin dengan perbandingan larutan
ekstrak : wasbensin 1:1 vv, kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna. Fase air akan berada pada bagian bawah, sedangkan fase wasbensin berada pada
bagian atas. Dari hasil partisi diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi wasbensin dan fraksi
air. Selanjutnya fraksi air diekstraksi cair-cair lagi menggunakan etil asetat dengan perbandingan larutan fraksi air : etil asetat 1:1 vv sehingga didapatkan fraksi air
dan etil asetat. Setelah dipisahkan fraksi etil asetat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator. Hasil fraksi tersebut kemudian ditutup dengan plastik
serta aluminium foil lalu disimpan dalam desikator. Lalu hasil fraksi tersebut digunakan untuk dianalisis lebih lanjut.
4. Pembuatan larutan pembanding dan uji
a. Pembuatan larutan DPPH Sejumlah DPPH dilarutkan ke dalam metanol p.a sehingga diperoleh
larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.
b. Pembuatan larutan stok kuersetin Sebanyak 2,5 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0
mL. c. Pembuatan larutan pembanding
Diambil sebanyak 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 mL larutan stok kuersetin, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh
konsentrasi larutan standar kuersetin sebesar 5; 7,5; 10; 12,5; dan 15 gmL.
d. Pembuatan larutan uji 1. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan
Sebanyak 12,5 mg hasil fraksi etil asetat ditimbang, lalu di add metanol p.a sampai 25,0 mL. Diambil sebanyak 1,5; 3; 4,5; 6; 7,5 mL larutan
tersebut, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 75; 150; 225; 300; 375
gmL. 2. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total
Sebanyak 5,0 mg hasil fraksi etil asetat ditimbang, lalu ditambahkan metanol p.a sampai diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 500,0 µgmL.
e. Pembuatan larutan asam galat Dibuat larutan asam galat dengan konsetrasi 500 µgmL dalam
akuades : methanol p.a 1:1. Diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a 1:1 sampai
10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125; dan 150 µgmL.
5. Uji pendahuluan
a. Uji fenolik Sejumlah 0,5 mL larutan uji 500,0 µgmL dan larutan pembanding
asam galat 150,0 µgmL dimasukan ke dalam 3 tabung reaksi. Lalu ditambahkan 5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan
dengan akuades 1:10 vv kedalam tabung reaksi. Diamkan selama 10 menit. Tambahkan 4 mL larutan natrium karbonat 1 M. Kemudian amati warna
larutan tersebut.
b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukan ke dalam masing-masing
tiga tabung reaksi. Ditambahkan masing-masing dengan 1 mL metanol p.a, larutan pembanding kuersetin 37,5
gmL , dan larutan uji 200,0 gmL. Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3 mL metanol p.a. Larutan
tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah 30 menit, amati warna pada larutan tersebut.
6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Pada 3 labu ukur 10 mL, dimasukan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL
larutan DPPH. Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,080. Larutan
tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Diamkan selama OT. Lalu dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm. b. Penentuan operating time OT
Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masing-masing 3 labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2 mL larutan
pembanding kuersetin 5; 10 dan 15 gmL. Selanjutnya larutan tersebut
ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang serapan maksimum selama 1 jam. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 75; 225; 375
gmL.
7. Uji aktivitas antioksidan
Uji aktivitas antioksidan ditentukan dengan menggunakan metode
spoktrofotometri sesuai dengan penelitian Rollando 2012.
a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH kontrol Pada labu ukur 10 mL, dimasukan sebanyak 2 mL larutan DPPH.
Ditambahan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang
maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji larutan pembanding dan uji.
b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi
bertutup kemudian ditambah dengan 1 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai seri konsentrasi telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut ditambah
dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan diamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakukan dengan 3 kali replikasi.
c. Validasi metode uji aktivitas antioksidan Hasil dari prosedur 7 a dan b, divalidasi presisi CV, spesifisitas
spektra kontrol, dan linearitas nilai r.
CV =
� � � � ��
� −
�
x 100
d. Estimasi aktivitas antioksidan Hasil dari prosedur 7 a dan b, dihitung nilai IC dan IC
50
untuk kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.
8. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total
Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total ditentukan dengan menggunakan metode spektrofotometri.
a. Penentuan OT Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 gmL
ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air 1:10 vv. Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat
1 M. Setelah itu, dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit.
b. Penentuan panjang gelombang maksimum Sebanyak 0,5 mL larut
an asam galat 50; 100; dan 150 gmL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan
air 1:1 vv. Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Diamkan selama OT,
absorbansinya dibaca pada maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 600-800 nm.
9. Penetapan kandungan fenolik total
a. Pembuatan kurva baku asam galat Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 gmL
ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air 1:1 vv. Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M.
Setelah OT, absorbansinya dibaca pada maksimum terhadap blanko yang terdiri
atas akuades : metanol p.a 1:1, reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1 M. Pengerjaan dilakukan 3 kali.
b. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total Hasil dari prosedur 9 a , divalidasi presisi CV, spesifisitas spektra
kontrol, dan linearitas nilai r. CV =
� � � � ��
� −
�
x 100
c. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji Diambil 0,5 mL larutan uji 50
0 gmL, lalu masing-masing dimasukan ke dalam labu takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada
pembuatan kurva baku asam galat . Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai gram ekivalen asam galat mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat.
Lakukan 3 kali replikasi.
F. Analisis Hasil
Aktivitas penangkapan radikal DPPH dihitung dengan rumus : Absorbansi
larutan kontrol
– Absorbansi
sampel larutan pembandinguji
X 100
Absorbansi
larutan control
Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC
50
mengunakan persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun
pembanding, sedangkan sumbu y adalah IC. Lalu dianalisis secara statistik
untuk menentukan ada atau tidak adanya perbedaan bermakna antara IC
50
larutan pembanding dan larutan uji.
Uji kandungan fenolik total menghasilkan nilai mg ekivalen asam galat dalam per g fraksi etil asetat. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linier
dengan data kurva baku secara intrapolasi.
Gambar 5. Skema jalannya penelitian
Determinasi tanaman
Pengumpulan dan preparasi bahan
Pembuatan ekstrak etanol daun dadap serep
Ekstraksi cair-cair dengan wasbensin dan air
Fraksi wasbensin Fraksi air
Ekstraksi cair-cair dengan etil asetat
Fraksi etil asetat Fraksi air II
Uji Pendahuluan
Optimasi uji antioksidan
Validasi metode uji aktivitas antioksidan
Estimasi aktivitas antioksidan
Analisis statistik Optimasi metode
penetapan kandungan fenolik total
Validasi metode penetapan kandungan
fenolik total
Estimasi kandungan fenolik total
31
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi
Dalam penelitian ini langkah pertama yang dilakukan adalah determinasi tanaman yang akan digunakan sebagai sampel uji. Tujuan dilakukannya
determinasi adalah untuk mengetahui kebenaran identitas tanaman yang digunakan serta untuk menghindari kesalahan dalam penggunaan tanaman saat
dilakukan penelitian. Determinasi tanaman dadap serep dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma dengan acuan buku Flora of Java Backer and Bakhuizen van den Brink, 1965. Dari hasil determinasi lampiran 1 yang dilakukan terbukti bahwa
tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah dadap serep Erythrina subumbrans Hassk. Merr..
B. Hasil Pengumpulan Bahan
Daun dadap serep yang digunakan diperoleh dari kebun tanaman obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Daun dipanen tanggal
21 september 2012. Daun dadap serep dipilih yang tidak layu, tidak terdapat bekas luka daun, masih berwarna hijau dan masih segar. Adanya luka daun pada
tanaman dapat menyebabkan timbulnya respon enzimatik terhadap luka pada daun tanaman tersebut. Polifenol oksidase merupakan suatu enzim ekstraseluler yang
akan mengoksidasi senyawa fenolik menjadi bentuk radikal dan membentuk polimer yang digunakan untuk menutup luka pada daun. Menurut Harborne
Kategori