diendap tuangkan dan diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari yang kedua Depkes, 1986. Alkohol didalam banyak penelitian merupakan pelarut
yang cocok untuk berbagai tujuan ekstraksi sebagai pelarut awal yang digunakan dalam tahapan ekstraksi Harborne, 1998.
Ekstraksi cair-cair digunakan sebagai cara untuk praperlakukan sampel untuk memisahkan analit-analit dari komponen-komponen matriks yang mungkin
menganggu pada saat kuantifikasi atau deteksi analit. Ekstraksi cair-cair ditentukan oleh distribusi Nerst atau hukum partisi
yang menyatakan “pada konsentrasi dan tekanan yang konstan, analit akan terdistribusi dalam proporsi
yang selalu sama diantara dua pelarut yang saling tidak c ampur”. Perbandingan
konsentrasi pada keadaan setimbang di dalam 2 fase disebut dengan koefisien distribusi atau koefisien partisi K
d
dan digambarkan dengan rumus : K
d
=
� �
Dimana [S]
org
dan [S]
aq
masing-masing merupakan konsentrasi analit dalam fase organik dan dalam fase air; K
d
merupakan koefisien partisi. Efiseiensi proses ekstraksi tergantung pada nilai distribusinya dan juga tergantung pada
volume relative kedua fase. Adanya ekstaksi berulang bertingkat akan meningkatkan efisiensi ekstraksi Gandjar dan Rohman, 2007.
F. Metode DPPH dan Folin-Ciocalteu
Metode DPPH merupakan metode yang sering digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan. Metode ini bertujuan untuk mengetahui parameter
konsentrasi yang ekivalen memberikan 50 efek aktivitas antioksidan IC
50
. Hal
ini dapat dicapai dengan cara mengintepretasikan data eksperimental dari metode tersebut Molyneux, 2004.
Uji kuantitatif daya antioksidan dilakukan dengan metode DPPH 1,1- difenil-2-pikrilhidrazil secara spektrofotometri sinar tampak. Metode ini
didasarkan pada perubahan warna radikal DPPH. Perubahan warna tersebut disebabkan oleh reaksi antara radikal bebas DPPH dengan satu atom hidrogen
yang dilepaskan senyawa yang terkandung dalam bahan uji untuk membentuk senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazin yang berwarna kuning. Pada metode ini
absorbansi yang diukur adalah absorbansi larutan DPPH sisa yang tidak bereaksi dengan senyawa antioksidan Josephy, 1997.
NO
2
O
2
N O
2
N N
N
+ AH
O
2
N NO
2
NO
2
H N
N
DPPH Free Radical DPPH Reduced Form
Phenolic Compounds
+
A
Gambar 4. Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan Irshad, Zafaryab, Singh, dan Rizvi, 2012
Dalam metode DPPH, dengan adanya elektron bebas yang tidak berpasangan pada senyawa radikal DPPH, senyawa tersebut memberikan serapan
maksimum yang kuat pada panjang gelombang 517 nm dan memberikan warna ungu. Warnanya berubah dari ungu menjadi kuning sebagai bentuk berkurangnya
absorptivitas molar radikal DPPH pada 517 nm dari 9660 ke 1640 ketika elektron bebas radikal DPPH dipasangkan dengan hidrogen dari senyawa antioksidan
radikal bebas untuk membentuk senyawa DPPH-H. Dengan demikian hasil dekolorisasi yang terjadi memberikan nilai stoikiometri sehubungan dengan
jumlah elektron yang ditangkap Prakash, 2001. Metode Folin-Ciocalteu F-C merupakan metode kolorimetri yang
sering digunakan yang berdasarkan reaksi oksidasi yang cepat dari fenol dengan menggunakan senyawa alkali, umumnya menggunakan sodium karbonat, yang
akan menghasilkan ion fenolat yang cukup besar. Senyawa fenolat yang terbentuk mereduksi warna kuning F-C menjadi berwarna biru, yang dapat diukur secara
spektrofotometri Cicco dan Lattanzio, 2011.
G. Validasi Metode
