Penetapan kandungan senyawa fenolik total dan uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air (nasturtium officinale r.br.) dengan menggunakan metode DPPH.

INTISARI

Polusi udara saat ini sudah menjadi salah satu masalah yang serius yang diakibatkan oleh pencemaran udara yang berasal dari kegiatan industri. Pencemaran udara memunculkan radikal bebas yang berakibat buruk bagi kesehatan manusia. Radikal bebas merupakan senyawa yang bersifat sangat reaktif dan memiliki pasangan elektron bebas, oleh karena itu diperlukan antioksidan yang bertujuan untuk menangkal aktivitas radikal bebas.Salah satu tanaman yang berpotensi sebagai antioksidan adalah selada air (Nasturtium officinale R.Br) yang telah lama dikonsumsi oleh masyarakat. Aktivitas antioksidan dari herba selada air berasal dari senyawa fenolik yang dapat menangkal radikal bebas, oleh karena itu dilakukan juga penetapan kandungan fenolik totalnya. Metode aktvitas antioksidan yang digunakan adalah dengan metode DPPH dengan prinsipnya adalah terjadi reduksi warna dari ungu menjadi kuning karena terbentuk senyawa DPPH tereduksi yang berasal dari reaksi radikal bebas dengan senyawa antioksidan. Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan IC50

yaitu kemampuan senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan untuk menurunkan 50% aktivitas dari radikal bebas. Dari hasil penelitian diperoleh kandungan senyawa fenolik total adalah (6,463 ± 0,066) mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat dan IC50 dari herba selada air adalah ( 434,402 ± 5,945)

µg/ml.

Kata kunci : antioksidan, radikal bebas, Nasturtium officinale R.Br, senyawa fenolik total, DPPH.

ABSTRACT

It is well known that air polution can be a serious problem to human health because it will produce a free radical. Free radical is a molecule that has a free electron chain and is so reactive that we will need antioxidants to reduce it.Watercress (Nastrutrium officinale R.Br) is one kind of plant that can inhibit free radical because its polyphenolic contents.We must exact contents of polyphenolic compunds. DPPH methods are used to determine antioxidant activity by reducing a colour from purple to yellow. Antioxidant activity is presented by IC50. IC50 is the ability of antioxidant that can reduce 50% of free

radical activity. According to this research we know that the total phenolic compounds is (6.463 ± 0.066) mg eqivalent gallic acid each gram fraction and IC50 is (434.402 ±5.945)µg/ml.

Key words :antioxidant, free radical, Nasturtium officinale R.Br, total phenolic compunds, DPPH.

PENETAPAN KANDUNGAN SENYAWA FENOLIK TOTAL dan UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOLIK HERBA SELADA AIR (Nasturtium officinale R.Br.) DENGAN

MENGGUNAKAN METODE DPPH

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Diajukan oleh: Jap Yulius Billy Soegianto

NIM : 098114069

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

iv

pihak yang telah membantuku.

vii

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas

berkat-Nya sehingga penulis berhasil menyelesaikan karya tulis “Penetapan Kandungan Senyawa Fenolik Total dan Uji Aktvitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak

Etanolik Herba Selada Air (Nastrurtium officinale R.Br.) Dengan Menggunakan

Metode DPPH ”.

Dalam penulisan skripsi ini penulis banyak mendapatkan bantuan dan

semangat dari berbagai pihak, maka pada kesempatan ini penulis menyampaikan

rasa terima kasih kepada:

1. Bapak Ipang Djunarko, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

2. Bapak Prof.Dr.C.J.Soegihardjo, Apt selaku Dosen Pembimbing yang

selalu mendampingi dan mengarahkan sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi dengan baik.

3. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si selaku Dosen Penguji yang memberikan

masukkan dan arahan sehingga dapat menyelesaikan skripsi dengan baik.

4. Bapak Jeffry Julianus, M.Si selaku Dosen Penguji yang memberikan

pengarahan dalam penulisan skrpsi.

5. Semua dosen Fakultas Farmasi Sanata Dharma yang telah memberikan

masukkan, ilmu dan dukungannya kepada penulis.

6. Teman-teman yang telah membantu selama penelitian, Filbert Hita

Kumaro, dan Indah Kertawati yang memberikan bantuan sehingga

viii

7. Laboran Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Biokimia–Anatomi Manusia Universitas Sanata Dharma,yaitu Mas Kayat dan Mas Wagiran

yang telah membantu dalam penyelesian skripsi ini .

8. Semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian skripsi ini yang

tidak dapat disebutkan satu-persatu

Penulis mengetahui bahwa penulisan skripsi ini masih belum sempurna,

oleh karena itu masukkan, saran dan kritikannya sangat diperlukan untuk

memperbaiki penulisan skripsi ini. Terima kasih.

ix

Halaman

HALAMAN JUDUL ... i

PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iii

PENGESAHAN SKRIPSI ... iii

PERSEMBAHAN ... iv

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ... v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... vi

PRAKATA ... vii

DAFTAR ISI ... ix

DAFTAR TABEL ... xiii

DAFTAR GAMBAR ... xivv

DAFTRA LAMPIRAN...xv

INTISARI ... xvii

ABSTRACT ... xvii

BAB I. PENGANTAR ... 1

A. Latar Belakang ... 1

1. Permasalahan... 5

2. Keaslian penelitian... 6

3. Manfaat penelitian... 6

B. Tujuan Penelitian ... 7

x

A. Selada Air ... 8

1. Nama lain selada air...8

2. Morfologi tanaman selada air...8

3. Kandungan kimia...9

4. Sistematika selada air...10

B. Senyawa Fenolik ... 10

1. Pengertian senyawa fenolik... 10

2. Senyawa fenolik dan antioksidan... 11

3. Senyawa fenolik pada tanaman... 11

4. Kandungan Senyawa Fenolik Total Selada Air...12

C. Metode Folin-Ciocalteu ... 13

D. Antioksidan...14

1. Pengertian antioksidan... 14

2. Sumber antioksidan...15

3. Penggolongan antioksidan...17

4. Metode uji aktivitas atioksidan...18

E. Radikal Bebas...20

1. Pengertian radikal bebas...20

2. Kerusakan sel akibat radikal bebas...20

3. Pembentukan radikal bebas...21

4. Radikal bebas dalam tubuh...22

F. Metode Ekstraksi...23

xi

H. Hipotesis...26

BAB III. METODE PENELITIAN... 27

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 27

B. Variabel Penelitian ... 27

C. Definisi Operasional ... 28

D. Bahan dan Alat Penelitian ... 29

1. Alat... 29

2. Bahan...29

E. Tata Cara Penelitian ... 29

1. Determinasi tanaman... 29

2. Pengumpulan bahan... 29

3. Preparasi sampel...30

4. Penetapan kandungan fenolik total...30

5.Pembuatan larutan DPPH, pembanding dan uji aktivitas antioksidan...32

6.Penentuan OT dan panjang gelombang maksimum uji aktivitas antioksidan...33

7.Uji pendahuluan dan estimasi aktivitas antioksidan pada larutan uji dan pembanding...33

F. Analisis Hasil...34

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 36

xii

C. Hasil Preparasi Sampel ... 37

1. Pengeringan...37

2. Ekstraksi...38

3. Fraksinasi...41

D. Hasil Uji Pendahuluan ... 43

1. Uji pendahuluan kandungan senyawa fenolik total...43

2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan...45

E. Hasil Optimasi Penetapan Knadungan Fenolik Total...46

1. Penetapan Operating Time (OT)...46

2. Pengukuran panjang gelombang maksimum...47

F. Hasil Penetapan Kandungan Fenolik Total...48

G. Hasil Optimasi Penentuan Aktivitas Antioksidan...52

1. Penentuan Operating Time (OT)...52

2. Penentuan panjang gelombang maksimum...54

H. Hasil Penentuan Aktivitas Antioksidan...55

BAB V KESIMPULAN dan SARAN...63

A. Kesimpulan ... 63

B. Saran ... 63

DAFTAR PUSTAKA ... 64

LAMPIRAN ... 68

xiii

Halaman

Tabel I. Penentuan panjang gelombang maksimum asam galat ... 48

Tabel II. Persamaan regresi linier dari baku asam galat...50

Tabel III. Kandungan senyawa fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik

herba selada air ... 51

Tabel IV. Penentuan panjang gelombang maksimum DPPH ... 54

Tabel V. Persamaan regresi linier % IC dengan baku rutin...59

Tabel VI. Perhitungan persamaan regresi linier % IC dengan baku fraksi etil

asetat ekstrak etanolik herba selada air...59

Tabel VII. Nilai IC50 rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada

air...60

xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Mekanisme penghambatan radikal bebas oleh senyawa fenolik...11

Gambar 2. Struktur rutin ... 13

Gambar 3. Reaksi DPPH dengan senyawa antioksidan...19

Gambar 4. Uji pendahuluan kandungan senyawa fenolik total... 44

Gambar 5. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan...46

Gambar 6. Penentuan Operating Time (OT) asam galat replikasi 2 ... ...47

Gambar 7. Struktur asam galat . ... 50

Gambar 8. Operating Time (OT) rutin replikasi 1 ...53

Gambar 9. Operating Time (OT) fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air replikasi 3 ... 53

Gambar 10. Reaksi antara DPPH dengan antioksidan...55

Gambar 11. Struktur kimia rutin...56

Gambar 12. Mekanisme penghambatan DPPH oleh rutin...57

Gambar 13. Kurva aktivitas antioksidan rutin replikasi 3...58

Gambar 14. Kurva aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air replikasi 2 ... 59

xv

Halaman

Lampiran 1. Lampiran Surat Determinasi Tanaman...68

Lampiran 2. Gambar Selada Air...69

Lampiran 3. Perhitungan Rendemen Uji Aktivitas Antioksidan...70

Lampiran 4. Data Penimbangan Uji Aktivitas Antioksidan...71

Lampiran 5. Data Konsentrasi Uji Aktivitas Antioksidan...72

Lampiran 6. Penentuan Operating Time (OT) Rutin...74

Lampiran 7. Penentuan Operating Time (OT) Fraksi Etil Asetat...76

Lampiran 8. Panjang Gelombang Maksimum DPPH...78

Lampiran 9. Scanning Penentuan Aktivitas Antioksidan...81

Lampiran 10. Perhitungan Nilai % IC Dari Rutin...84

Lampiran 11. Perhitungan % IC Fraksi Etil Asetat...86

Lampiran 12. Perhitungan Nilai IC50 Rutin...88

Lampiran 13. Perhitungan Nilai IC50 Fraksi Etil Asetat...90

Lampiran 14. Penimbangan Untuk Uji Kandungan Fenolik Total...92

Lampiran 15. Optimasi Penetapan Kandungan Fenolik Total...93

Lampiran 16. Panjang Gelombang Maksimum Asam Galat...94

Lampiran 17. Scanning Penentuan Kandungan Fenolik Total...97

Lampiran 18. Penentuan Kandungan Senyawa Fenolik Total...100

xvi

INTISARI

Polusi udara saat ini sudah menjadi salah satu masalah yang serius yang diakibatkan oleh pencemaran udara yang berasal dari kegiatan industri. Pencemaran udara memunculkan radikal bebas yang berakibat buruk bagi kesehatan manusia. Radikal bebas merupakan senyawa yang bersifat sangat reaktif dan memiliki pasangan elektron bebas, oleh karena itu diperlukan antioksidan yang bertujuan untuk menangkal aktivitas radikal bebas.Salah satu tanaman yang berpotensi sebagai antioksidan adalah selada air (Nasturtium officinale R.Br) yang telah lama dikonsumsi oleh masyarakat. Aktivitas antioksidan dari herba selada air berasal dari senyawa fenolik yang dapat menangkal radikal bebas, oleh karena itu dilakukan juga penetapan kandungan fenolik totalnya. Metode aktvitas antioksidan yang digunakan adalah dengan metode DPPH dengan prinsipnya adalah terjadi reduksi warna dari ungu menjadi kuning karena terbentuk senyawa DPPH tereduksi yang berasal dari reaksi radikal bebas dengan senyawa antioksidan. Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan IC50

yaitu kemampuan senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan untuk menurunkan 50% aktivitas dari radikal bebas. Dari hasil penelitian diperoleh kandungan senyawa fenolik total adalah (6,463 ± 0,066) mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat dan IC50 dari herba selada air adalah ( 434,402 ± 5,945)

µg/ml.

Kata kunci : antioksidan, radikal bebas, Nasturtium officinale R.Br, senyawa fenolik total, DPPH.

xvii ABSTRACT

It is well known that air polution can be a serious problem to human health because it will produce a free radical. Free radical is a molecule that has a free electron chain and is so reactive that we will need antioxidants to reduce it.Watercress (Nastrutrium officinale R.Br) is one kind of plant that can inhibit free radical because its polyphenolic contents.We must exact contents of polyphenolic compunds. DPPH methods are used to determine antioxidant activity by reducing a colour from purple to yellow. Antioxidant activity is presented by IC50. IC50 is the ability of antioxidant that can reduce 50% of free

radical activity. According to this research we know that the total phenolic compounds is (6.463 ± 0.066) mg eqivalent gallic acid each gram fraction and IC50 is (434.402 ±5.945)µg/ml.

Key words :antioxidant, free radical, Nasturtium officinale R.Br, total phenolic compunds, DPPH.

1

BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang

Udara mempunyai arti yang sangat penting di dalam kehidupan makhluk

hidup dan kelangsungan hidup makhluk lainnya,sehingga udara merupakan

sumber daya alam yang harus dilindungi untuk hidup kehidupan manusia dan

makhluk hidup lainnya. Pertumbuhan sektor industri pertahun masih merupakan

sektor yang sangat potensial dalam memacu pertumbuhan ekonomi, namun disisi

lain juga dapat memberikan dampak negatif berupa pencemaran udara baik yang

di dalam ruangan maupun di luar ruangan yang dapat membahayakan manusia

(Anonim, 2002).

Kegiatan industri dapat menimbulkan pencemaran udara antara lain

pabrik pengolahan minyak bumi, pabrik pengolahan logam, pabrik tekstil, pabrik

gula, pabrik pengolahan karet dan pabrik plastik. Pabrik kimia tersebut

menghasilkan semua pencemar ke udara lewat cerobong asap pabrik-pabrik kimia

baik yang berbentuk gas ataupun partikel dan berpengaruh buruk bagi kesehatan (

Sumardjono,2006). Pencemaran udara merupakan masuknya komponen lain ke

dalam lingkungan udara baik oleh kegiatan manusia secara langsung atau tidak

langsung maupun proses alam sehingga kualitas udara turun sampai ke tingkat

tertentu yang dapat menyebabkan lingkungan menjadi kurang baik. Adapun

0,26 ppm (Chandra,2006). Akibatnya adalah muncul radikal bebas di lingkungan

yang tentunya berbahaya bagi kesehatan manusia.

Radikal bebas adalah suatu atom atau molekul yang sangat reaktif

dengan elektron yang tidak memiliki pasangan. Radikal bebas mencari

reaksi-reaksi agar dapat memperoleh kembali elektron pasangannya. Serangkaian reaksi-reaksi

dapat terjadi, yang menghasilkan serangkaian radikal bebas. Setelah itu radikal

bebas dapat mengalami tubrukan kaya energi dengan molekul lain yang merusak

ikatan di dalam molekul, pada akhirnya radikal bebas dapat merusak membran

sel, retikulum endoplasma, atau DNA sel yang rentan (Corwin, 2008). Radikal

bebas merusak DNA yang dapat mengakibatkan sel kanker (Mazandarani et al,

2012).

Pada dasarnya tubuh manusia memiliki antioksidan untuk membatasi

kerusakan akibat terpapar radikal bebas. Salah satu antioksidan alami yang paling

efektif adalah vitamin E. Vitamin ini larut dalam lemak dan sangat penting karena

sebagian besar kerusakan oleh radikal bebas terjadi pada membran sel dan

lipoprotein berkepadatan rendah. Antioksidan alami tubuh lainnya mencakup

senyawa seperti cystein, glutathion dan D-penicillamin, serta isi darah misalnya

molekul transferin yang mengandung zat besi dan seruloplasmin protein (

Youngson, 2003).

Senyawa antioksidan adalah senyawa pemberi elektron. Secara biologis,

antioksidan adalah senyawa yang mampu menangkal atau meredam dampak

negatif oksidan dalam tubuh. Antioksidan bekerja dengan cara mendonorkan satu

oksidan tersebut bisa dihambat. Keseimbangan oksidan dan antioksidan sangat

penting karena berkaitan dengan berfungsinya sistem imunitas tubuh. Kondisi

seperti ini terutama untuk menjaga integritas dan berfungsinya membran lipid,

protein sel, dan asam nukleat, serta mengontrol transduksi sinyal dan ekspresi gen

dalam sel imun (Winarsih,2007).

Sumber antioksidan dapat dibagi menjadi dua kelompok,yaitu antioksidan

sintetik, yaitu antioksidan yang diperoleh dari hasil sintesis reaksi kimia dan

antioksidan alami, yaitu antioksidan yang berasal dar alam (Prabantini, 2010).

Tumbuhan mengandung berbagai jenis senyawa kimia yang berpotensi sebagai

antioksidan, namun yang paling penting adalah vitamin C, vitamin E, senyawa

fenol, dan thiol. Senyawa fenol meliputi flavonoid (turunan inti flavan), cincin

kroman (tokoferol), dan lignan. Sayur-sayuran kaya akan zat gizi (vitamin,

mineral, dan serat pangan) serta berbagai kelompok zat bioaktif lain yang disebut

zat fitokimia. Zat bioaktif ini bekerja secara sinergis, meliputi mekanisme enzim

detoksifikasi, peningkatan sistem kekebalan dan antioksidan (Silalahi, 2006).

Negara Indonesia adalah suatu negara kepulauan yang memiliki hutan

tropika terbesar kedua di dunia, kaya dengan keanekaragaman hayati dan dikenal

sebagai salah satu dari negara megabiodiversity. Sebagai mana telah diketahui

bersama, tumbuh-tumbuhan tersebut memiliki manfaat yang besar bagi

kehidupan manusia antara lain untuk kebutuhan sandang ,papan energi, dan

sumber ekonomi (Ersam, 2004). Tanaman banyak mengandung senyawa aktif

seperti senyawa fenolik yang dapat bertindak sebagai antioksidan. Penggunaan

DNA pada manusia yang berujung pada timbulnya berbagai penyakit (Ozen.,

2009). Salah satu tanaman tersebut adalah selada air ( Nasturtium officinale R.Br).

Selada air (Nasturtium officinale R.Br) merupakan tanaman dengan

batang menjalar. Batang ini yang diambil untuk dijadikan sayuran. Selada air

dimanfaatkan sebagai mengobati TBC dan rasa panas di paru-paru, mengobati

gangguan dan iritasi pada kulit. Kandungan zat gizi dan fitonutrien yang

terkandung di dalamnya adalah provitamin A (karotenoid) dan vitamin C, minyak

atsiri berupa rapanol dan serat (Wirakusumah, 2004). Adanya kandungan vitamin

C pada selada air dimungkinkan terdapat aktifitas antioksidan karena vitamin C

dapat bertindak sebagai peningkatan sistem kekebalan di dalam tubuh, oleh karena

itu diperlukan suatu keseimbangan antara pembentukan radikal bebas dan proteksi

antioksidan (Silalahi, 2006). Selada air diduga dapat bertindak sebagai antikanker

berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Selain itu, tanaman selada air juga

banyak ditemui sehingga dapat dengan mudah untuk didapatkan dan diteliti

aktivitas antioksidannya.

Pemilihan pelarut ekstraksi dengan menggunakan etanol juga didasarkan

pada penelitian yang telah dilakukan oleh (Ozen,2009 ) yang menyebutkan bahwa

dengan menggunakan pelarut etanol menghasilkan aktifitas antioksidan yang lebih

besar dibandingkan dengan menggunakan pelarut yang lain. Pada penelitian yang

dilakukan oleh (Mazandarani, Momeji, Moghaddam, 2013), menyebutkan bahwa

pada selada air (Nasturtium officinale R) terdapat kandungan senyawa flavonoid

total, yaitu sebesar (26,57±1,16) mg ekivalen dari kuarsetin untuk sampel

serta memiliki nilai aktifitas antioksidan yang dinyatakan sebagai IC50, Sebesar

1227,5 µg/ml dengan metode TAC .

Pada penelitian ini digunakan metode DPPH untuk menentukan aktivitas

antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik karena dengan digunakannya radikal

bebas DPPH dapat digunakan untuk menangkap aktivitas antioksidan dari sampel

yang ditandai dengan nilai IC50. Nilai IC50 adalah nilai yang dibutuhkan oleh

suatu sampel untuk menangkap radikal bebas sebanyak 50%. Pada uji aktivitas

antioksidan dengan menggunakan metode DPPH telah dilakukan untuk

mengukur aktivitas antioksidan telah digunakan untuk pengukuran antioksidan

dari daun dewa dan hasilnya dinyatakan sebagai IC50 (Widyaningsih,2010).

Penelitian ini juga menggunakan metode Folin-Ciocalteu dalam penetapan kadar

senyawa fenolik total dengan prinsip adalah terjadinya reduksi ion fenolat oleh

Folin-Ciocalteu yang kemudian dapat ditetapkan kadarnya dengan menggunakan

spekrtoskopi, metode ini telah digunakan untuk menetapkan senyawa fenolik total

pada sampel kulit buah pinang ( Ismail, Runtuwene, Fatimah, 2010). Oleh karena

itu, penelitian ini menggunakan metode DPPH untuk mengukur aktivitas

antioksidan dan metode Folin-Ciocalteu untuk pengukuran kandungan senyawa

fenolik total.

1. Permasalahan

a. Berapakah nilai aktivitas antioksidan dari fraksi etil asetat ekstrak etanolik

herba selada air dan pembanding rutin dengan metode DPPH yang

b. Berapakah kandungan senyawa fenolik total dari fraski etil asetat ekstrak

etanolik herba selada air tersebut yang dinyatakan sebagai mg ekivalen

asam galat per gram fraksi?

2. Keaslian penelitian

Sejauh pengamatan yang diketahui oleh peneliti, penelitian ini belum

pernah dilakukan, adapun untuk penelitian serupa yang pernah dilakukan oleh

(Mazandari, et al,2013) dengan judul Evaluation of Phytochemical and

Antioxidant Activities From Different Parts of (Nasturtium officinale R. Br). Pada

penelitian ini sampel herba selada air diambil dari provinsi Mazandaran dan

dilakukan juga penetapan kadar senyawa flavonoid total dengan menggunakan

metode aluminium klorida, dan penentuan aktivitas antioksidan dengan

menggunakan metode TAC dengan pembanding BHA dan BHT ( Ozen, 2009)

dengan judul Investigation Of Antioxidant Properties of (Nasturtium Officinale)

(Watercress) Leaf Extract. Pada penelitian ini sampel herba selada air diperoleh

dari daerah Arhavi-Artvin, Turki, pada periode Juni-Juli (2006). Metode aktivitas

antioksidan pada penelitian ini adalah dengan menggunakan metode besi tiosianat.

Perbedaan penelitian ini dengan penelitian yang pernah dilakukan

sebelumnya adalah tempat diambilnya sampel selada air yang diambil dari daerah

Kaliurang, Indonesia dan metode uji aktivitas antioksidan yang berbeda yaitu

dengan menggunakan metode DPPH dengan pembanding rutin.

3. Manfaat penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai

kandungan senyawa fenolik total dan mengetahui aktivitas antioksidan fraksi etil

asetat ekstrak etanolik pada herba selada air (Nasturtium officinale R.Br )

menggunakan metode DPPH .

b. Manfaat praktis

Penelitian ini dapat memberikan informasi kepada masyarakat tentang

penggunaan herba selada air sebagai sumber antioksidan alami yang dapat

melawan radikal bebas.

c. Manfaat metodologis

Penelitian ini dapat memberikan informasi mengenai aplikasi

penggunaan metode DPPH sebagai salah satu uji aktivitas antioksidan yang

terdapat pada bahan alam.

B. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini, yaitu untuk mengetahui kandungan senyawa

fenolik total yang dinyatakan sebagai mg ekivalen asam galat per gram fraksi dan

menentukan aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik dari herba

selada air (Nasturtium officinale R.Br) dan pembanding rutin yang dinyatakan

8

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Selada Air 1. Nama lain selada air

Tanaman selada air (Nasturtium officinale R. Br) termasuk dalam famili

Brasicacea .Tanaman ini memiliki berbagai nama lain sebagai berikut : Pani

(Hindi), selada air (Indonesia), nasturcio , agretto aquatico (Italia), berro de agua

, berro de fuente ( Spanyol), wodjanoj kren, sherucha wodnaja, brunkress (Rusia),

Echte Brunnenkresse, Bachkresse, Waserkresse, Wassersenf, Wiesenkren

(Jerman), Xong (Vietnam).(Seidemann,2005). Nama sinonim dari tanaman ini

adalah Caradaminum nasturtium Moench, Crucifera fontana E.H.L. Krause,

Nasturtium aquaticum Wahlenb, Nasturtium nasturtium Cockerell, Rorippa

nasturtium –aquaticum (L.) Hayek, Sisymbrium nasturtium Thunb (Seidemann, 2005).

2. Morfologi tanaman selada air

Tanaman selada air merupakan tanaman air yang mendapatkan nutrisi

dari langsung dari air dan dapat tumbuh di sungai kecil ataupun tumbuh di

pinggir sungai yang memiliki air yang cukup tinggi. Tanaman selada air memiliki

ciri-ciri batang yang tipis, merambat dan terkadang mengapung di atas air. Setiap

daun terdiri dari 3 sampai 11 anak daun. Bunga berwarna kecil dan berukuran

kecil dengan mahkota berbentuk silang. Bentuk buah siliques berukuran panjang

3. Kandungan kimia

Senyawa yang terkandung dalam selada air (Nasturtium officinale)

adalah adanya senyawa flavonoid yang terdapat di dalam selada air. Berdasarkan

penelitian yang telah dilakukan oleh (Mazandarani, et al, 2010) menyebutkan

bahwa kandungan flavonoid totalnya sebesar 26,5 mg ekivalen quarsetin pada fase

vegetatif dan 36,89 mg ekivalen kuarsetin pada fase generatif. Kandungan

senyawa lain yang berpotensi sebagai antioksidan dalam spesies Brassica adalah

lutein dan β karoten. Vitamin E dalam bentuk α tokoferol dapat bertindak sebagai senyawa antioksidan dengan memberikan atom hidrogennya ke senyawa radikal

bebas dan juga terdapat kandungan vitamin C yang dapat bertindak sebagai

antioksidan dengan mekanisme penangkapan radikal hidroksil dan superoksida.

(Pilar, Tamara, Pablo, and Maria, 2011).

4. Sistematika selada air

Tanaman selada air memiliki taksnomi sebagai berikut :

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Viridaeplantae

Infrakingdom : Sterptophyta

Divisi : Tracheophyta

Subdivisi : Spermathophyta

Infradivisi : Angiospermae

Class : Magnoliopsida

Superordo : Rosanae

Famili : Brassicaceae

Genus : Nasturtium

Spesies : Nasturtium officinale R. Br.

( Anonim, 2013)

B. Senyawa Fenolik 1. Pengertian senyawa fenolik

Senyawa fenol mempunyai cincin aromatik yang mengandung bermacam

gugus pengganti yang menempel, seperti gugus hidroksil , karboksil , metoksil

(-O-CH3), dan sering juga berstruktur cincin bukan aromatik. Senyawa fenol

berbeda dengan lipid, yaitu lebih larut dalam air dan kurang larut dalam pelarut

organik tak-polar. Beberapa agak larut dalam eter, khususnya jika jika pH cukup

rendah untuk mencegah ionisasi gugus karboksil dan hidroksil yang ada ( Frank.,

1995).

Banyak senyawa fenol juga dihasilkan dari lintasan asam sikimat dan reaksi

berikutnya diantaranya adalah asam sinamat, p-kumarat, kafeat, ferulat, dan gallat.

Gallat akan diubah menjadi galotanin, polimer heterogen yang mengandung

berbagai molekul asam galat yang saling terkait dengan asam galat lain serta

dengan sukrosa dan gula lainnya. Banyak galotanin yang sangat menghambat

pertumbuhan tanaman, dan ketahanan tumbuhan karena galotanin diangkut ke

vakuola dan disitu mereka tidak dapat merombak enzim sitoplasma (Frank.,

2. Senyawa fenolik dan antioksidan

Dari sekian banyak senyawa fenolik di alam, flavonoid merupakan

golongan terbesar, disusul fenolmonosiklik sederhana, fenilpropanoid, dan kuinon

fenolik. Di alam, senyawa fenolik kerap dijumpai terikat pada protein, alkanoid,

dan terdapat di antara terpenoid. Flavonoid berperan sebagai antioksidan karena

dapat menangkap radikal bebas dengan melepaskan atom hidrogen dari gugus

hidroksilnya. Pemberian atom hidrogen ini akan menyebabkan radikal bebas

menjadi stabil dan berhenti melakukan perusakan terhadap lipida, protein dan

DNA. Flavonoid dapat menghentikan tahap awal rekasi dengan melepaskan satu

atom hidrogen kemudian berikatan dengan satu radikal bebas. Selanjutnya,

dengan mekanisme seperti itu, radikal peroksi dapat dihancurkan atau distabilkan

oleh resonansi dari gugus hidroksil yang membuat energi aktivasinya berkurang

( Ide., 2008).

OH

RH +

O

+ R

O

H

O

H

(Silalahi, 2006).

Gambar 1. Mekanisme penghambatan radikal bebas oleh senyawa fenolik

3.Senyawa fenolik pada tanaman

Senyawa fenolik di dalam tanaman terdiri dari satu atau lebih struktur

tanaman dan merupakan hasil dari metabolit sekunder. Fungsi senyawa fenolik

pada tanaman adalah sebagai pelindung terhadap sinar UV, parasit, atau terhadap

agen patogen. Senyawa fenolik yang terdapat di dalam tanaman meliputi asam

fenolat, flavonoid dan tanin. Senyawa flavonoid terbagi menjadi 6 sub bagian

tersendiri, yaitu: flavons, flavonols, flavanols, flavanones, isoflavones dan

antosianin ( Dai and Mumper, 2010).

Senyawa fenolik terdapat secara luas di dalam tanaman salah satu

tanaman yang memiliki senyawa polifenol adalah teh hijau (Camellia sinensis)

adalah sebagai berikut epicatechin, epigallocatechin, epicatechin-3-gallate dan

epigallo-catechin-3-gallate.Senyawa fenolik ini terdapat pada daun teh yang

masih segar (Anesini, Ferarro,and Filip, 2008). Senyawa fenolik dapat ditemukan

pada tanaman berkayu. Senyawa fenolik menyebabkan eksplan cepat berubah

warna menjadi coklat dan mengering bahkan sesudah terbentuk kalus. Senyawa

fenol tersebut akan teroksidasi membentuk quinon yang bersifat racun terhadap

sel-sel tanaman ( Hendaryono, dan Wijayani,1994).

4.Kandungan senyawa fenolik pada tanaman selada air (Nasturtium officinale R.Br).

Kandungan senyawa fenolik yang terdapat pada tanaman selada air

(Nasturtium officinale) antara lain adalah terdapat senyawa flavonoid total pada

tanaman ini yang telah dilakukan penelitian oleh (Mazandarani,et al, 2010).

Senyawa flavonoid merupakan senyawa fenolik yang memiliki aktivitas

antioksidan yang kuat. Kuersetin merupakan salah satu senyawa fenolik yang

mengoksidasi dari reaksi radikal bebas. Pada penelitian ini digunakan standard

antiokisdan rutin karena efek penghambatan flavonoid rutin dan quersetin

terhadap peroksidasi lipid bergantung pada ion Fe dalam lesitin liposom. Senyawa

flavonoid tersebut bekerja dengan cara mengkelat logam, serta menangkap

aktivitas radikal bebas. Dalam hal ini terjadi interaksi rutin dengan ion

superoksida. Rutin secara signifikan lebih efektif menghambat sistem peroksidasi

lipid yang tergantung ion Fe. Pengkelatan ion Fe menyebabkan kompleks ion inert

dan tidak dapat mengawali terjadinya peroksidasi lipid,mekanisme pengkelatan

rutin lebih kuat dibandingkan dengan vitamin C. (Winarsih., 2007).

O

O

O OH

HO

OH

OH

Rhamoglikosida

Gambar 2. Struktur rutin

C. Metode Folin-Ciocalteu

Senyawa fenolik dapat ditetapkan dengan metode Folin-Ciocalteu.

Prinsip kerja dari metode ini adalah reaksi reduksi oksidasi. Reagen Folin– Ciocalteu merupakan reagen pengoksidasi berupa larutan berwarna kuning.

Senyawa fenolik dalam sampel akan dioksidasi oleh molybdotungstate yang

Reaksi antara senyawa fenolik dengan Folin–Ciocalteu berjalan lambat pada suasana asam, sehingga perlu penambahan natrium bikarbonat agar terbentuk

suasana basa dan reaksi dapat berjalan lebih cepat. Penggunaan metode ini telah

digunakan oleh (Agustiningsih, Wildan, dan Mindaningsih, 2010) dalam

menetapkan kandungan senyawa fenolik pada ekstrak daun pandan wangi

( Pandanus amaryllifous Roxb ).

Pengukuran dengan Folin-Ciocalteu digunakan untuk pengukuran

senyawa fenolik total. Prinsipnya berdasarkan pada rekasi oksidasi dari senyawa

fenolik dan reduksi dari senyawa yang memiliki kromofor. Jika dalam sampel

tersebut t terdapat agen pereduksi seperti asam askorbat, asam amino, xantin dan

protein akan mengganggu pada pengukuran ini ( Makar., 2003). Reagen ini

terdiri dari campuran polimer anionik yang akan tereduksi menjadi warna biru.

Struktur dari bentuk kromofor ini tergantung dari sifat fenolik dan panjang

gelombang maksimum pada 760 nm ( Hemingway and Laks,1992).

D. Antioksidan 1. Pengertian antioksidan

Senyawa antioksidan adalah senyawa pemberi elektron. Secara biologis

pengertian antioksidan adalah senyawa yang mampu menangkal atau meredam

dampak dari oksidan dalam tubuh. Antioksidan bekerja dengan cara mendonorkan

satu elektronnya kepada senyawa yang bersifat oksidan sehingga aktivitas

2. Sumber antioksidan

a. Antioksidan alami

Tumbuhan mengandung berbagai jenis antioksidan , namun yang paling

penting adalah vitamin C, vitamin E, senyawa fenol (meliputi flavonoid, tokoferol

dan lignin). Khasiat antioksidan untuk mencegah bahaya radikal bebas terdapat

pada tanaman dan buah-buahan yang kaya akan antioksidan. Mekanisme kerja

dari zat tersebut sebagai antiokisdan adalah sebagai berikut.

1) Vitamin E

Vitamin E atau tokoferol adalah inhibitor terhadap lipida peroksidasi.

Terdapat delapan jenis tokoferol alam yang mempunyai aktivitas sebagai

vitamin E, tetapi alfa tokoferol yang paling aktif secara biologis.

Tokoferol suatu antiokisdan yang sangat efektif, yang dengan mudah

menyumbangkan atom hidrogen pada gugus hidroksil (OH) dari struktur

cincin ke radikal bebas sehingga radikal bebas menjadi tidak reaktif.

Dengan menyumbangkan hidrogen, vitamin E sendiri menajdi suatu

radikal , tetapi lebih stabil karena elektron yang tidak berpasangan pada

atom oksigen mengalami delokalisasi ke dalam struktur cincin

aromatik(Silalahi, 2006).

2) Vitamin C

Vitamin C merupakan suatu antioksidan penting yang larut dalam air.

Vitamin C secara efektif menagkap radikal-radikal O2-, OH, peroksil dan

oksigen singlet, dan juga berperan dalam melindungi membrane biologis.

sitosol, vitamin C dapat melindungi membran biologis dari kerusakan

peroksidatif. Sifat penting dari vitamin C sebagai antioksidan pertama,

karena mempunyai potensial reduksi yang rendah sehingga radikal

askorbil mampu bereaksi dengan radikal biologis dan mereduksi

oksidan-oksidan. Stabilitas dan reaktivitas yang rendah dari radikal askorbil, yang

terbentuk ketika askorbat yang menangkap SOR dan senyawa nitrogen

yang reaktif (Silalahi, 2006).

3) β karoten

Senyawa karotenoid bekerja sebagai antioksidan, yakni penangkap

radikal bebas, terutama radikal peroksil dan hidroksil maupun oksigen

singlet. Sebagai antioksidan, beta karoten memperlambat fase inisiasi.

Senyawa ini lebih efektif sebagai antiokisdan biologis terutama pada

bagian yang memiliki tekanan partial oksigen rendah ( Silalahi, 2006).

b. Antioksidan sintetik

Antioksidan sintetik merupakan antiokisdan yang dibuat di pabrik untuk

tujuan tertentu misalnya untuk mengawetkan makanan. Sebagai contoh dari

senyawa antiokisdan sintetik adalah BHA (Butil Hidroksi Anisol), BHT (Butil

hidroksi toluena) dan TBHQ (Tersier Butil Hidro Quinon ). Namun saat ini

penggunaan dari antiokisdan bautan mulai dibatasi penggunaannya karena dapat

3. Penggolongan antioksidan

Berdasarkan mekanisme kerjanya , antioksidan digolongkan menjadi tiga

kelompok, yaitu antioksidan primer, sekunder, dan tersier.

a. Antioksidan primer

Antioksidan primer meliputi enzim superoksida dismutase (SOD) ,

katalase, dan glutation peroksidase (GSH-Px). Suatu senyawa dikatakan sebagai

antioksidan primer, apabila dapat memberikan atom hydrogen secara tepat kepada

senyawa radikal, kemudian radikal antioksidan yang terbentuk segera berubah

menjadi senyawa yang lebih stabil.sebagai antioksidan, enzim-enzim tersebut

menghambat pembentukan radikal bebas, dengan cara memutus rekasi berantai

polimerisasi), kemudian mengubahnya menjadi produk yang lebih stabil (Winarsi,

2007).

b. Antioksidan sekunder

Antioksidan sekunder disebut juga antioksidan eksogenus atau non

enzimatis. Antioksidan dalam kelompok ini juga disebut sistem pertahanan .

Dalam sistem pertahanan ini, terbentuknya senyawa oksigen reaktif dihambat

dengan cara pengkelatan metal atau dirusak pembentukannya. Pengkelatan metal

terjadi dalam cairan ekstraseluler. Antioksidan non-enzimatis dapat berupa

komponen-nutrisi dan komponen nutrisi dari sayuran dan buah-buahan. Kerja

sistem antioksidan non enzimatik, yaitu dengan cara memotong reaksi oksidasi

berantai dan radikal bebas atau dengan cara menangkapnya. Akibatnya, radikal

bebas tidak akan bereaksi dengan komponen seluler. Antioksidan sekunder

c. Antioksidan tersier

Kelompok antioksidan tersier meliputi enzim DNA repair dan metionin

sulfoksida reduktase. Enzim-enzim ini berfungsi sebagai perbaikan biomolekuler

yang rusak akibat reaktivitas radikal bebas. Kerusakan DNA yang terinduksi

senyawa radikal bebas dicirikan dengan rusaknya single dan double strand, baik

gugus non-basa maupun basa ( Winarsi, 2007).

4. Metode uji aktivitas antiokisdan

a. Metode DPPH

Salah satu metode yang digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan

suatu bahan adalah dengan menggunakan radikal bebas DPPH. DPPH adalah

radikal bebas yang bersifat stabil dan beraktivitas dengan cara mendelokasi

elektron bebas pada suatu molekul, sehingga molekul tersebut tidak aktif

sebagaimana radikal bebas yang lain. Proses delokalisasi ini ditunjukkan dengan

adanya warna ungu (violet) pekat yang dapat dikaraterisasi pada absorbansi

(Molyneux, 2004).

Pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode DPPH menggunakan

prinsip spektrofotometer. Senyawa DPPH akan berwarna ungu pada panjang

gelombang 517 nm. Suatu senyawa dapat dikatakan memiliki aktivitas

antioksidan apabila senyawa tersebut mampu mendonorkan atom hidrogennya

untuk berikatan dengan DPPH membentuk DPPH tereduksi,ditandai dengan

semakin hilangnya warna ungu menjadi kuning (Molyneux, 2004). Struktur

DPPH dan DPPH tereduksi hasil reaksi dengan antioksidan adalah sebagai

O₂N

NO₂ NO₂

N N + DH _O

2N

NO₂ NO2

N N _{+ D}

H

Gambar 3. Reaksi DPPH dengan senyawa antioksidan

b. Metode CUPPRAC

Metode pengukuran aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode

Cupprac menggunakan bahan bis (neurokoprin) tembaga (II) sebagai pewarna

kromogenik. Pereaksi bis (neurokoprin) tembaga (II) yang berwarna biru akan

mengalami reaksi reduksi setelah senyawa yang berpotensi sebagai antiokisdan

ditambahkan ke dalamnya dan akan mengakibatkan terbentuknya warna kuning

dari hasil reaksi reduksi menjadi bentuk bis (neurokoprin) tembaga (I).

Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 453,4 nm (Widyastuti., 2010).

c. Metode FRAP

Metode pengujian antiokisdan dengan metode FRAP menggunakan

kompleks besi ligan 2,4,6 –tripiridil –triazin sebagai pereaksi. Senyawa kompleks ini memiliki warna biru akan berfungsi sebagai zat yang melakukan pengoksidasi

dengan adanya senyawa antioksidan dan akan mengalami reaksi reduksi yang

menghasilkan produk yang berwarna kuning pada suasana asam .Pengukuran

kemudian dilakukan pada panjang gelombang 598 nm. Metode pengujian ini

kondisi reaksi secara termodinamika dan memiliki laju reaksi yang cukup cepat

( Widyastuti, 2010).

Dari ketiga metode pengujian antioksidan yang ada, peneliti memilih

menggunakan pengujian dengan metode DPPH karena metode ini lebih praktis

dibandingkan dengan menggunakan pengujian aktivitas antioksidan dengan

menggunakan metode yang lain.

E. Radikal Bebas 1. Pengertian radikal bebas

Radikal bebas merupakan suatu atom ataupun gugus yang memiliki satu

ataupun lebih elektron yang tak berpasangan. Karena jumlah elektron ganjil,

sehingga tidak semua elektron dapat berpasangan. Meskipun suatu radikal bebas

tidak bermuatan positif atau negatif, spesi ini sangat reaktif karena adanya

elektron tidak berpasangan. Suatu radikal bebas biasanya dijumpai sebagai zat

antara yang tak dapat diisolasi usia pendek, sangat reaktif, dan berenergi tinggi

( Fessenden and Fessenden, 1992).

2. Kerusakan sel akibat radikal bebas

Radikal oksigen dan turunannya dapat mematikan sel. Radikal hidroksil

menyebabkan kerusakan oksidatif terhadap protein, DNA, lemak membran yang

mengandung lebih dari satu ikatan rangkap pada rantai hidrokarbon, dan

komponen sel lain. Protein, membran, karbohidrat dan asam nukleat dapat

menjadi rusak karena akibat radikal bebas oksigen. Kerusakan radikal bebas ini

asam amino prolin, hisitidin, arginin, sistein, dan metionin rentan terhadap

serangan radikal hidroksil dan kerusakan oksidatif. Oksidasi asam amino dalam

protein menimbulkan fragmentasi protein, pembentukan ikatan silang dan

agregrasi ( Marks, Momeji, and Moghaddam, 1996).

3. Pembentukan radikal bebas

Proses oksidasi merupakan proses yang meyebabkan atom mengalami

peningkatan jumlah ikatan dengan oksigen atau penurunan jumlah ikatan dengan

hidrogen atau kehilangan elektron. Oksigen merupakan molekul unsur memiliki

konfigurasi elektron dwiradikal. Reaksi terbentuknya radikal bebas terdiri dari 3

tahap yaitu inisiasi, propagasi, dan terminasi(Cairns, 2004).

a. Inisiasi

Pada tahap ini terjadi pembelahan (fisi) homolitik ikatan kovalen di

dalam molekul obat dan menghasilkan radikal bebas. Sumber energi pada proses

ini berasal dari cahaya, baik cahaya ultraviolet maupun cahaya tampak yang

mengenai sampel. Cahaya dengan panjang gelombang ini cukup energetik untuk

memecah pasangan elektron dalam suatu ikatan kovalen dan menghasilkan dua

radikal (Cairns, 2004).

b. Propagasi

Propagasi meruapkan reaksi kimia yang utama. Pada langkah ini

radikal bebas bereaksi bersama-sama dan menghasilkan lebih banyak lagi spesies

yang berekasi. Pada oksidasi, tahap propagasi ini melibatkan pembentukan

lebih lanjut dan menghasilkan aldehid serta keton yang memiliki berat molekul

kecil (Cairns, 2004).

c. Terminasi

Radikal bebas reaktif bergabung bersama membentuk ikatan kovalen,

dan secara efektif proses reaksi rantai dan mengahsilkan senyawa yang stabil

(Cairns, 2004).

4. Radikal bebas dalam tubuh

Radikal bebas juga mucul di dalam proses fungsi normal di dalam sel.

Proses metabolisme memerlukan banyak reaksi kimia yang melibatkan aksi dari

radikal bebas, sebagai contoh adalah penggabungan rantai-rantai asam amino

(polimerisasi) untuk membentuk protein atau polimerisasi dari molekul glukosa

menjadi polisakarida menjadi glikogen,melibatkan aksi radikal bebas. Dalam

proses metabolisme juga diproduksi radikal bebas yang penting dan berpotensi

bahaya seperti radikal peroksida dan hidroksil (Youngson,1998). Bahaya radikal

bebas dalam tubuh telah penelitian yang menggunakan ikan kerapu yang diinduksi

dengan radikal bebas. Radikal bebas juga dapat menyebabkan berbagai macam

penyakit misalnya pada penyakit Parkinson, kerusakan disebabkan akibat

pembentukan radikal bebas oksigen yang berlebihan atau berkurangnya

kemampuan inaktivasi radikal bebas di dalam inti ganglion basal. Karena nukleus

kaudatus striatum tersebut juga berperan dalam fungsi emosi dan kognitif,

defisiensi sintesis neurotransmitter yang disebabkan oleh kerusakan sel yang

F. Metode Ekstraksi

Ekstraksi merupakan proses pemisahan senyawa kimia yang terdapat

pada tanaman atau hewan ataupun komponen lain dengan menggunakan pelarut

yang sesuai. Senyawa kimia yang didapatkan dari proses ekstraksi merupakan

campuran dari hasil metabolit ataupun senyawa lain yang terdapat pada tanaman.

Pada tanaman merupakan sumber senyawa fenolik yang cukup banyak, proses

ekstraksi untuk mendapatkan senyawa fenolik ini tergantung dari berat molekul,

polaritas konsentrasi, jumlah gugus hidroksil dan cincin aromatik. Di dalam

sampel terdapat berbagai variasi struktur dari senyawa fenolik itu sendiri,

misalnya terdapat flavonoid, asam fenolat, antosianin dan proantosianin, oleh

karena itu diperlukan metode ekstraksi yang tepat (Khoddami, Wilkes,and

Roberts,2013).

Pemilihan pelarut pada proses ekstraksi sangat tergantung dari sifat fisika

kimia bahan aktif yang terdapat dalam sampel tanaman. Pemilihan pelarut yang

baik untuk proses ekstraksi meliputi tidak bersifat toksik, mudah diuapkan pada

suhu yang rendah, dapat mengawetkan hasil ekstraksi, tidak mengakibatkan

kerusakan pada senyawa yang terdapat dalam sampel. Faktor yang cukup penting

untuk pemilihan pelarut adalah jumlah senyawa fitokimia yang dapat diekstrak,

lama proses ekstraksi, keberagaman jumlah senyawa aktif yang dapat diekstraksi,

meskipun dalam proses ekstrkasi terdapat pelarut yang masih sisa, pelarut tersebut

harus tidak toksik dan tidak mengganggu dalam proses pengukuran selanjutnya,

pemilihan pelarut tergantung dari senyawa yang akan diekstrak ( Tiwari, Kumar ,

Pada penelitian ini metode ekstraksi yang digunakan adalah dengan

menggunakan metode maserasi karena tidak dilakukan pemanasan dengan

maserasi sehingga dapat digunakan untuk mengestraksi senyawa yang bersifat

termostabil. Metode maserasi dilakuakn dengan cara mencampurkan serbuk

dengan pelarut yang sesuai sampai pada waktu beberapa hari dan kemudian

sampai semua senyawa yang dituju dalam sampel dapat terekstraksi. Metode

maserasi yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan pelarut etanol 70%

karena dengan konsentrasi etanol 70% dapat mendapatkan senyawa aktif

bioflavonoid yang tinggi dibandingkan dengan menggunakan etanol yang murni.

Hal ini disebabkan karena etanol 70% terdiri dari 30% kandungan air sehingga

mengakibatkan kepolaran dari pelarut akan meningkat sehingga akan

mempermudah dalam proses ekstraksi, etanol 70% akan mengakibatkan penetrasi

ke dalam membran seluler untuk mengekstraksi bahan material intraseluler.

Alasan lain digunakan pelarut etanol adalah tidak toksik dan lebih aman

dibandingkan dengan pelarut metanol ( Tiwari, et al, 2011) .

Penelitian ini tidak menggunakan penyarian dengan alat Sokletasi karena

teknik ini diperlukan dengan melakukan pemanasan untuk sampel sampai 900C meskipun untuk melakukannya hanya diperlukan beberapa jam saja dibandingkan

dengan metode maserasi yang memerlukan hingga beberapa hari. Senyawa

fenolik meruapakan senyawa yang bersifat termolabil sehingga bila dilakukan

dengan penyarian dengan alat Sokletasi akan mengakibatkan rusaknya senyawa

fenolik yang menjadi target utama dalam proses ekstraksi ( Khoddami, et al,

banyak cairan pelarut yang digunakan dibandingkan dengan menggunakan

metode maserasi karena pelarut tersebut terus-menerus akan dimasukkan ke dalam

perkolator sampai semua bahan metabolit sekunder tersebut sudah tersari semua

dan juga harus selalu diguankan pelarut yang baru sehingga dirasakan kurang

efisien dibandingkan dengan metode maserasi ( Tiwari,et al, 2011).

G. Landasan Teori

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan dan

kandungan senyawa fenolik total dari herba selada air (Nasturtium officinale R.

Br). Senyawa fenolik total merupakan senyawa golongan flavonoid yang

berpotensi sebagai penangkap radikal bebas dengan melepaskan satu atom

hidrogennya ke molekul radikal bebas sehingga akan mengalami reaksi reduksi.

Radikal bebas merupakan senyawa yang bersifat tidak stabil dan akan berbahaya

bagi kesehatan jika masuk ke dalam tubuh dalam kurun waktu yang cukup lama.

Oleh karena itu, dilakukan penelitian tentang sumber antioksidan yang berasal

dari alam.

Metode pengujian aktivitas antioksidan yang dilakukan adalah dengan

menggunakan radikal DPPH, di mana DPPH akan mengalami proses reduksi

karena adanya senyawa antioksidan yang akan mengakibatkan senyawa radikal itu

akan kehilangan sifat radikalnya. Pengukuran aktivitas antiokisdan dinyatakan

dengan IC50, yaitu besarnya konsentrasi senyawa antioksidan yang mampu

menurunkan aktivitas dari DPPH sebesar 50%. Pengujian senyawa fenolik

dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu yang prinsipnya adalah melakukan

kemudian untuk hasil senyawa fenolik total dinyatakan sebagai mg ekivalen asam

galat per gram fraksi.

H. Hipotesis

1. Herba selada air (Nasturtium officinale R.Br) mengandung senyawa fenolik.

2. Nilai aktivitas rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air dapat

27

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental karena subjek uji

diberi perlakuan selama proses penelitian .

B. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah konsentrasi dari rutin dan fraksi

etil asetat ekstrak etanolik herba selada air .

2. Variabel terikat

Varibel terikat pada penelitian ini adalah nilai % IC.

3. Variabel pengacau terkendali

Varibel pengacau terkendali pada penelitian ini adalah tempat tumbuh

tanaman selada air.

4. Variabel pengacau tak terkendali

Varibel pengacau tak terkendali pada penelitian ini adalah usia tanaman

C. Definsi Operasional 1. Herba selada air

Herba selada air diperoleh dari perkebunan di Kaliurang, Yogyakarta.

Sayuran didapatkan dari pemasok sayuran segar yaitu dari depo sayur segar.

Herba selada air yang diguankan dalam penelitian ini adalah keseluruhan herba

selada air yang meliputi daun dan batang kecuali akar.

2. Ekstrak etanolik herba selada air

Ekstrak etanolik herba selada air adalah ekstrak kental yang diperoleh

dari serbuk selada air dengan menggunakan pelarut etanol teknis 70% dengan

metode maserasi. Ekstrak kental didapatkan dengan menggunakan vaccum rotary

evaporator.

3. Fraksi etil asetat dari herba selada air.

Fraksi etil asetat herba selada air adalah ekstrak kental yang diperoleh

dari ekstrak kental etanolik yang sudah melalui proses farksinasi. Ekstrak kental

dari fraksi etil asetat dipekatkan dengan vaccum rotary evaporator .

4. Persen IC.

Persen IC merupakan kemampuan penangkapan fraksi etil asetat untuk

menangkap radikal bebas yang diperoleh dari nilai absorbansi.

5. IC50

IC50 merupakan besarnya konsentasi senyawa sampel yang mampu

D. Alat dan Bahan

Pada penelitian ini alat dan bahan yang digunakan adalah sebagai

berikut:

1. Alat

Alat –alat yang digunakan adalah spektrofotometer UV-1240, Seperangkat alat –alat gelas dari pyrex, kuvet, vaccum rotary evaporator ( Junke & Kunkle), neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), waterbath ( labo- tech

,Heraeus), blender, oven, printer.

2. Bahan

Bahan-bahan yang diguankan adalah serbuk herba selada air, etanol

70% kualitas farmasetis, wasbensin, etil asetat dari P.T Brataco, rutin, DPPH,

reagen Folin-Ciocalteu diperoleh dari Sigma.Chem, metanol p.a. diperoleh dari

E. Merck, natrium karbonat, aquadest yang didapat dari laboratorium

Farmakognosi-Fitokimia.

E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman pada penelitian ini dilakukan di Laboratorium

Farmakognosi-Fitokimia, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

2. Pengumpulan bahan

Pengumpulan bahan dilakukan di Kaliurang pada pagi hari, kemudian

jika terlalu lama akan terjadi browning. Pemanenan dilakukan pada bulan Februari

2013.

3. Preparasi sampel

Sampel segar berupa herba selada air sebanyak 4,3 kg dikeringkan

dengan menggunakan oven pada suhu 400C selama 2 hari. Setelah itu herba yang sudah kering digiling dengan blender sampai terbentuk serbuk yang halus. Serbuk

kemudian dimaserasi dengan menggunakan pelarut etanol 70% selama dua hari .

Setelah itu memisahkan ampas dengan pelarut menggunakan corong Buchner.

Ampas sisa kemudian diremaserasi selama dua hari. Setelah itu dipisahkan antara

pelarut dan ampas dengan menggunakan corong Buchner, kemudian

mencampurkan antara pelarut satu dan dua yang diperoleh dari hasil maserasi

yang pertama dan hasil remasearsi dan dipekatkan menggunakan vaccum rotary

evaporator sampai diperoleh ekstrak kental etanolik. Ekstrak kental etanolik yang

diperoleh kemudian dilarutkan dengan menggunakan aquades hangat sebanyak

300 ml, kemudian dipartisi dengan menggunakan wasbensin, fase wasbensin

dibuang dan diambil fase air. Setelah itu fase air dipartisi lagi dengan

menggunakan etil asetat, sehingga didapatkan fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat

yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan menggunakan vacum rotary

evaporator sampai diperoleh ekstrak kental fraksi etil asetat. Fraksi inilah yang

akan digunakan untuk penelitian lebih lanjut.

4. Penetapan kandungan fenolik total

Kandungan fenolik total ditentukan dengan menggunakan metode

a. Pembuatan kurva baku asam galat

Sebanyak 0,5 ml larutan asam galat 50, 75, 100, 125 dan 150 µg/ml

ditambahkan dengan 5 ml larutan reagen Folin- Ciocalteu yang telah diencerkan

dengan menggunakan aquadest dengan perbandingan (1:10) kemudian

ditambahkan dengan 4,0 ml larutan Na2CO3 1M. Setelah 30 menit, absorbansinya

dibaca pada panjang gelombang 760 nm.

b. Optimasi penetapan kandungan fenolik total

1 ) Penentuan OT (Operating Time)

Sebanyak 0,5 ml larutan induk asam galat 50, 100 dan 150 µg/ml

ditambahkan dengan 5,0 ml reagen Folin-Ciocalteu yang telah

diencerkan dengan aquadest (1:10) dan kemudian ditambahkan dengan

4,0 ml larutan Na2CO3 1M. Absorbansi diukur setiap 5 menit pada

panjang gelombang 760 nm selama 40 menit.

2 ) Penentuan panjang gelombang maksimum

Sebanyak 0,5 ml larutan asam galat 50, 100 dan 150 µg/ml ditambahkan

dengan 5,0 ml larutan reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan

dengan aquadest dengan perbandingan (1:10) kemudian ditambahkan

dengan 4,0 ml larutan Na2CO3 1 M selanjutnya dilakukan scanning pada

panjang gelombang 600- 800 nm.

c. Estimasi penetapan kadar senyawa fenolik total sampel

Sebanyak 0,5 ml larutan sampel dengan kosentrasi 500 µg/ml

ditambhakan dengan 5,0 ml reagen Folin- Ciocalteu yang telah diencerkan

4,0 ml larutan Na2CO3 1M , diamkan selama 30 menit dan dibaca absorbansinya

pada panjang gelombang maksimum 448,6 nm. Kandungan fenolik total

dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat ( mg ekivalen asam galat per g

fraksi etil asetat).

5. Pembuatan larutan DPPH, pembanding dan uji aktivitas antioksidan

a. Pembuatan larutan DPPH

Sejumlah tertentu DPPH dilarutkan dengan menggunakan metanol p.a.

pada labu ukur 10 ml sehingga didapatkan konsentrasi larutan DPPH sebesar 0,4

mM.

b. Pembuatan larutan pembanding

1) Pembuatan larutan induk rutin

Sebanyak 2,5 mg rutin ditimbang dan kemudian dilarutkan metanol p.a

pada labu ukur 10 ml, sehingga didapatkan konsentrasi larutan induk

sebesar 250 µg/ml.

2) Pembuatan larutan stok

Dari larutan induk diambil sebanyak 0,6 ml, 0,7 ml, 0,8 ml, 0,9 ml dan

1,0 ml dan kemudian dilarutkan dengan metanol p.a. sehingga diperoleh

kadar sebesar 15 µg/ml, 17,5 µg/ml, 20 µg/ml, 22,5 µg/ml dan 25 µg/ml.

c. Pembuatan larutan uji

Ditimbang 20 mg sampel kemudian dilarutkan dengan menggunakan

metanol p.a. dalam labu ukur 10 ml sampai batas tanda. Dari larutan induk

sehingga didapatkan kadar seri larutan uji sebesar 350 µg/ml, 375 µg/ml , 400

µg/ml, 425 µg/ml, 450 µg/ml.

6. Penentuan Operating Time(OT) dan panjang gelombang maksimum uji aktivitas antioksidan

a. Penentuan Operating Time (OT)

Penentuan OT dilakukan untuk melihat waktu yang diperlukan oleh

larutin uji dengan DPPH untuk berekasi secara sempurna. Pada penentuan OT ini

untuk larutan pembanding dilakukan pada konsentrasi 15 µg/ml, 20 µg/ml , dan

25 µg/ml. Dilakukan pengukuran absorbansi dari menit ke 5 sampai menit ke 60,

pembacaan absorbansi dilakukan setiap 5 menit. OT ditandai dengan penurunan

absorbansi yang relatif lebih stabil. Dilakukan juga untuk larutan uji sebesar 350

µg/ml, 400 µg/ml dan 450 µg/ml. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.

b. Pengukuran panjang gelombang maksimum

Pengukuran panjang gelombang maksimum dilakukan pada konsentrasi

DPPH sebesar 0,02 mM, 0,04 mM dan 0,08 mM. Dilakukan scanning pada

panjang gelombang 400-600 nm, kemudian penentuan panjang gelombang

maksimum didapatkan dari hasil ketiga rata-rata pengukuran DPPH dengan tiga

konsentrasi yang berbeda.

7. Uji pendahuluan dan estimasi aktivitas antioksidan pada larutan uji dan pembanding

a. Uji pendahuluan

Disiapkan 3 buah tabung reaksi. Pada tabung pertama diisi dengan

menggunakan 1 ml metanol p.a. dan 1 ml larutan DPPH 0,4 mM, tabung kedua

tabung ketiga dengan 1 ml larutan uji sebesar 400 µg/ml dan 1 ml larutan DPPH

, setelah itu diamkan selama 30 detik dan amati perubahan warna yang terjadi.

b. Estimasi pengukuran aktivitas antioksidan larutan pembanding

Estimasi pengukuran aktivitas antioksidan dari senyawa pembanding

yaitu rutin dilakukan pada seri larutan baku 15 µg/ml, 17,5 µg/ml, 20 µg/ml,

22,5µg/ml dan 25 µg/ml. Setelah itu, direkasikan dengan larutan DPPH 0,4 mM

dan diamkan selama OT, yaitu 30 menit dan pengukuran dilakukan pada panjang

gelombang maksimum, yaitu 515,5 nm. Pengukuran dilakukan dengan replikasi

sebayak 3 kali.

c. Estimasi pengukuran aktivitas antioksidan larutan uji

Estimasi pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan pada seri larutan

baku sampel 350 µg/ml, 375 µg/ml, 400 µg/ml, 425 µg/ml dan 450 µg/ml. Setelah

itu direaksikan dengan larutan DPPH 0,4 mM dan diamkan selama OT, yaitu 30

menit dan pengukuran dilakkukan pada panjang gelombang maksimum yaitu

515,5 nm. Pengukuran dilakukan dengan replikasi sebanyak 3 kali.

F. Analisis Hasil

Analsis hasil untuk pengukuran aktivitas antioksidan yang dinyatakan

sebagai % IC dapat dilakukan dengan rumus :

AbsorbansiDPPH– Absorbansi sampel x 100%

Absorbansi DPPH

Kemudian dari data itu dianalisis dan dihitung nilai IC50 yang didapatkan

dari persamaan regresi linear. Persamaan regresi linear diperoleh dengan

sumbu y adalah nilai % IC dan kemudian dibandingkan terdapat perbedaan yang

bermakna antara nilai IC50 dari sampel dan pembanding.

Penetapan kandungan senyawa fenolik total yang dinyatakan sebagai

mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat diperoleh dengan memasukkan

absorbansi dari larutan uji ke dalam persamaan regresi linear dari kurva baku

36

BAB IV

HASIL dan PEMBAHASAN A.Determinasi Tanaman

Pada percobaan kali ini, peneliti menggunakan sumber acuan yang sesuai

dan kemudian dicocokkan dan hasilnya menunjukkan bahwa tanaman yang

dimaksud adalah selada air (Nasturtium officinale R. Br) yang digunakan pada

penelitian ini.

B.Pengumpulan Bahan

Pengumpulan bahan dilakukan di Kaliurang, Yogyakarta. Pemanenan

dilakukan pada pagi hari sebelum matahari terbit dan kemudian sesegera mungkin

dibawa ke laboratorium untuk dicuci dan segera dilakukan pengeringan. Pada

penelitian ini sampel tanaman herba selada air diperoleh dari pemasok sayuran

segar di Yogyakarta yaitu Depo Sayur Segar yang berada di Jalan Monjali.

Sampel segar yang diperoleh dipanen pada pagi hari sebelum matahari terbit,

tujuannya adalah supaya tidak terjadinya peristiwa browning. Peristiwa Browning

ini dapat terjadi karena proses adaptif dari tanaman karena adanya luka atau

karena proses penuaan. Peristiwa browning dapat disebabkan karena adaanya

pengaruh enzimatik dalam tanaman itu sendiri, yaitu senyawa fenolik yang

terdapat dalam tanaman oleh pengaruh enzim polifenol oksidase dengan bantuan

oksigen akan mengubah gugus monofenol menjadi gugus O- hidroksi fenol yang

selanjutnya diubah lagi menjadi O-kuinon, gugus inilah yang akan memberikan

Pemilihan sayur herba selada air yang digunakan tidak boleh ada yang

berwarna kuning pada daun ataupun batangnya, karena jika sudah terjadi

kekuningan terjadi peristiwa browning yang akan mengakibatkan rusaknya

senyawa fenolik di dalam tanaman karena aktivitas enzim polifenol oksidase

sehingga tidak dipilih sayuran yang sudah berwarna kekuningan, jadi dipilih

sayuran segar yang berwarna hijau. Pemanenan tanaman selada air dilakukan 2

jam setelah matahari terbit karena senyawa polifenol merupakan senyawa yang

bersifat termolabil sehingga bila dilakukan pemanenan pada siang hari akan

mengakibatkan rusaknya senyawa fenolik yang terdapat di dalam tanaman yang

akan dipanen.

C.Hasil Preparasi Sampel 1. Pengeringan

Sampel herba selada air segar sebanyak 4,5 kg kemudian dicuci dengan

air bersih yang mengalir tujuannya adalah untuk menghilangkan partikel-partikel

asing dan kotoran yang terdapat pada selada air dan dikhawatirkan akan

mengganggu dalam proses penelitian ini. Setelah sampel segar dicuci bersih

kemudian dilakukan pemotongan menjadi beberapa bagian yang lebih kecil

adapun tujuannya adalah lebih cepat dalam proses pengeringan karena akan

memperluas luas kontak permukaan dari sampel tersebut setelah dilakukan

pemotongan supaya proses pengeringan dapat berjalan lebih cepat karena air yang

terdapat didalam sampel selada air dapat lebih cepat menguap karena adanya

Setelah itu sampel yang sudah dipotong-potong dimasukkan ke dalam

oven dengan suhu 400 C selama 2 hari. Penggunaan suhu 40 0C dilakukan supaya tidak merusak senyawa fenolik yang berpotensi sebagai antioksidan karena

senyawa fenolik mudah rusak oleh adanya panas.

Tujuan dilakukan pengeringan adalah supaya kandungan air yang

terdapat di dalam sampel dapat diuapkan sehingga mengurangi resiko terjadinya

kontaminasi dari pertumbuhan bakteri, jamur ataupun organisme lain karena air

merupakan salah satu media yang baik untuk pertumbuhan bakteri ataupun

organisme hidup lainnya dan lebih mudah untuk dibuat dalam proses

penyerbukan. Setelah kering herba yang sudah kering kemudian digiling dan

kemudian dijadikan serbuk dan hasil yang didapatkan setelah penyerbukan adalah

151,1 g serbuk kering, jadi rendemennya sebesar 3,513 %.

2. Ekstraksi

Serbuk kemudian ditimbang dan dibagi menjadi tujuh sehingga berat

masing- masing serbuk yang terbagi adalah 21,58 gram. Serbuk kemudian

dilakukan maserasi dengan menggunakan pelarut etanol. Alasan diguanakannya

pelarut etanol adalah sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh (Tevin, 2009)

yang menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode

DPPH dengan menggunakan pelarut etanol menunjukkan absorbansi yang lebih

rendah dibandingkan dengan menggunakan pelarut air. Selain itu, penggunaan

pelarut etanol bisa digunakan untuk mengambil senyawa polifenol yang terdapat

pada tanaman karena dengan penggunaan cairan etanol pada proses maserasi

senyawa polifenol akan keluar. Penggunaan pelarut etanol 70% yang digunakan

dalam proses ekstraksi dengan menggunakan metode maserasi dikarenakan

pelarut etanol 70% memiliki polaritas yang lebih tinggi dibandingkan dengan

etanol murni yaitu 99- 100 % sehingga senyawa aktif bioflavonoid akan lebih

banyak tertangkap pada konsetrasi etanol 70%. Etanol mudah memasuki ke dalam

membran sel untuk mengekstraksi bahan-bahan intraseluler dari dalam sel seperti

senyawa fenolik dan komponen organik lainnya ( Tiwari,et al, 2007).

Pada penelitian ini metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi

tidak menggunakan metode ekstraksi lain yang menggunakan proses pemanasan

seperti yang dilakukan dengan penyarian dengan alat Sokletasi, karena senyawa

polifenol merupakan senyawa yang bersifat termolabil sehingga bila digunakan

dengan penyarian menggunakan alat Sokletasi akan mengakibatkan rusaknya

senyawa polifenol yang akan didapatkan. Begitu juga dengan menggunakan

metode ekstrkasi dengan cara refluks, dan infundasi karena metode ini juga

menggunakan proses pemanasan. Metode perkolasi tidak digunakan dalam

penelitian ini karena metode ini memerlukan waktu yang cukup lama dan

digunakan cukup banyak pelarut yang akan digunakan, selain itu metode ini juga

hanya mendapatkan komponen yang diinginkan tidak terlalu banyak sehingga

dipilih dengan metode maserasi.

Maserasi dilakukan selama dua hari dan dilakukan pada suhu kamar,

tujuan dilakukannya ekstraksi dengan metode maserasi adalah untuk

mendapatkan senyawa polfenol yang terdapat dalam sel tanaman, metode

terdapat gaya tekanan putar sehingga menyebabkan senyawa aktif bioflavonoid

yang merupakan metabolit sekunder dapat keluar dari dalam sel menuju ke cairan

pelarut. Pelarut etanol yang digunakan menyebabkan perbedaan tekanan osmotik

di dalam dan diluar sel sehingga air masuk ke dalam sel tumbuhan dan

menyebabkan zat aktif yang berada di dalam sel tumbuhan akan keluar, peristiwa

tersebut akan terus berulang hingga terjadi keseimbangan antara larutan didalam

sel dan didalam sel. Setelah dua hari perendaman kemudian untuk memisahkan

antara ampas dengan pelarut dengan menggunakan corong Buchner dengan

tujuan untuk memisahkan antara pelarut dengan serbuk, digunakan juga dengan

bantuan pompa vakum untuk mempermudah proses ekstraksi

Sampel diremaserasi kembali dengan menggunakan pelarut etanol 70%

selama dua hari dengan tujuan supaya jika masih ada metabolit sekunder yang

masih belum tersari saat dilakukan maserasi yang pertama diharapakan dapat

tersari pada maserasi yang kedua, kemudian setelah dua hari dipisahkan kembali

antara pelarut dan serbuk dan kemudian dicampur dengan hasil masearsi yang

pertama, selanjutnya untuk mendapatkan ekstrak etanolik yang kental digunakan

vaccum rotary evaporator yang berdasarkan prinsip kerjanya adalah berdasarkan

perbedaan dari titik didih sehingga dapat memisahkan secara baik antara etanol

dan zat filtrat. Selanjutnya, untuk filtrat yang sudah kental dikeringkan dengan

cara dipanaskan di atas penangas uap sekitar suhu 40- 500 C digunakan suhu tidak terlalu tinggi dengan tujuan supaya tidak merusak senyawa fenolik yang bersifat

dari hasil itu didapatkan berat ekstrak etanolik kental sebesar 30,8629 g dengan

rendemen sebesar 20,425% dihitung dari serbuk kering yang diperoleh.

3. Fraksinasi

Setelah didapatkan ekstrak etanolik yang kental, dilanjutkan dengan

fraksinasi adapun tujuan dilkukannya fraksinasi adalah untuk mendapatkan

komponen senyawa spesifik yang akan dicari. Pada penelitian ini senyawa yang

dicari adalah senyawa fenolik yang terkandung dalam sel tanaman. Pelarut etanol

yang digunakan dalam proses maserasi selain melarutkan senyawa fenolik tetapi

selain itu juga dapat melarutkan senyawa organik lainnya yang tidak dikehendaki

seperti lipid, klorofil dan senyawa organik lainnya, oleh karena itu untuk

mendapatkan senyawa fenolik yang dituju perlu dilakukan fraksinasi.

Proses fraksinasi pada penelitian ini dilakukan dengan melarutkan

sampel dari hasil ekstraksi yang menghasilkan ekstrak kental etanolik dengan

menggunakan 300 ml air hangat dengan tujuan untuk melarutkan ekstrak etanolik

yang sudah didapatkan supaya dapat dilakukan ekstraksi cair-cair. Pada ekstraksi

cair-cair pada prinsipnya menggunakan dua macam pelarut yang berbeda yang

nantinya akan digojog sehingga diharapkan senyawa yang dituju dapat terambil

pada salah satu pelarut yang digunakan selama proses fraksinasi.

Setelah dilarutkan dengan air hangat, kemudian dilakukan fraksinasi

dengan menggunakan pelarut wasbensin yang bersifat non polar. Tujuan

dilakukan partisi dengan wasbensin adalah untuk menghilangkan senyawa non

dalam sel tanaman ( Dai, et al, 2010). Selanjutnya campuran antara air dan

wasbensin tersebut digojog dengan menggunakan corong pisah dengan tujuan

supaya senyawa nonpolar dapat tertarik dari ke dalam fase wasbensin. Fraksi

wasbensin berada di atas air hal tersebut disebabkan karena adanya perbedaan

dari berat jenis antara kedua pelarut yang digunakan dalam fraksinasi itu. Adapun

berat jenis untuk air 0,996 sedangkan berat jenis untuk wasbnesin adalah 0,730

(Anonim,1995). Fraksi air yang didapatkan kemudian digunakan kembali untuk

dilakukan fraksinasi lagi dengan menggunakan etil asetat sedangkan fase

wasbenin dibuang.

Proses fraksinasi pada penelitian dilakukan dengan 3 kali pemisahan

yaitu masing-masing 100 ml untuk setiap kali melakukan fraksinasi, hal ini

bertujuan supaya didapatkan hasil fraksinasi yang optimal karena menurut

hukum Nerst koefisen distribusi (KD) merupakan perbandingan antara zat terlarut

di dalam kedua pelarut yang tidak saling campur yang nantinya akan berpindah

karena terjadi kejenuhan dan berdistribusi ke salah satu pelarut karena perbedaan

kepolarannya, sehingga untuk mendapatkan hasil yang baik diperlukan beberapa

kali proses fraksinasi.

Setelah didapatkan fraksi air selanjutnya dilakukan fraksinasi lagi

dengan, menggunakan etil asetat, digunakan etil asetat karena penggunaan etil

asetat dapat adalm proses fraksinasi akan mengakibatkan senyawa –senyawa aktif yang terdapat dalam sel tanaman dapat berpindah dari fase air menuju ke

memiliki sifat semi-polar. Salah satu senyawa fenolik yang dapat tertarik masuk

ke dalam fraksi etil asetat adalah flavonoid.

Fraksinasi dengan menggunakan fraksi etil asetat juga untuk memisahkan

bentuk glikon (terikat dengan gula) dan aglikonnya (bentuk tidak terikat dengan

gula), sedangkan senyawa lain yang masuk ke dalam fraksi air adalah senyawa

fenolik yang bersifat polar dan dalam bentuk aglikon. Pada penelitian ini yang

diambil adalah fraksi dari etil asetat, dalam corong pisah fraksi etil asetat akan

berada di bagian bawah sedangkan fraksi air akan berada di bagian atas hal ini

disebabkan karena perbedaan dari berat jenis. Berat jenis untuk air adalah 0,996

sedangkan berat jenis untuk etil asetat adalah 0,898 (Anonim, 1995).

Setelah dilakukan pemisahan dengan menggunakan corong pisah

didapatkan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air kemudian dipekatkan

dengan menggunakan vaccum rotary evaporator, setelah didapatkan ekstrak

kental fraksi etil asetat ekstrak etanolik setelah bobot tetap adalah 1,3043 g,

kemudian ekstrak kental disimpan di dalam desikator dengan ditutup aluminium

foil dengan tujuan supaya terhindar dari cahaya matahari secara langsung yang

dikhawatirkan dapat merusak senyawa fenolik yang berpotensi sebagai

antioksidan sehingga mempengaruhi hasil dalam penelitian.

D.Hasil Uji Pendahuluan 1. Uji pendahuluan kandungan senyawa fenolik total

Uji pendahuluan ini bertujuan untuk melihat ada atau tidaknya

dari herba selada air. Uji pendahuluan yang digunakan pada penelitian ini

menggunakan metode yang digunakan adalah dengan metode Folin-Ciocalteu.

Metode ini akan mengakibatkan terjadinya reduksi dari ion fenolat dan

senyawa lain yang bisa tereduksi, sehingga akan terjadi perubahan warna menjadi

biru pada susana yang basa.

Pada uji pendahuluan ini untuk melihat adanya kandungan senyawa

fenolik yang terdapatr pada sampel, dilakukan tiga tabung yang berisi kontrol

positif, kontrol negatif dan sampel. Kontrol positif yang berisi reagen

Folin-Ciocalteu, larutan natrium karbonat 1M dan larutan pembanding asam galat

dengan konsentrasi 100 µg/ml, sedangkan kontrol negatif yang berisi reagen

Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat dan sampel yang berisi larutan

sampel dengan konsentrasi 500 µg/ml, selanjutnya ditambahkan dengan reagen

kontrol negatif yang berisi reagen Folin-Ciocalteu, larutan Na2CO3 dan larutan

metanol p.a. : air (1:1). Kemudian didiamkan selama 30 detik dan diamati

perubahan warna yang terjadi.

Gambar 4. Uji pendahuluan kandungan senyawa fenolik total

Keterangan : tabung A ( fraksi etil asetat + Folin-Ciocalteu + Na2CO3), tabung B (asam

Setelah dilakukan pengamatan dapat dilihat bahwa terjadi perubahan

warna menjadi biru tua pada kontrol positif dan terjadi pula perubahan warna

menajdi biru yang terdapat pada larutan uji, tetapi tidak terjadi perubahan warna

pada kontrol negatif. Hal ini dapat disimpulkan bahwa sampel uji mengandung

senyawa fenolik yang dibuktikan dengan terajdinya perubahan warna menjadi biru

karena terjadi proses reduksi oleh reagen Folin-Ciocalteu pada suasana yang basa.

2.Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Uji pendahuluan ini bertujuan untuk melihat ada atau tidaknya aktivitas

antioksidan yang terdapat pada fraksi etil asetat ekstrak etanolik dari herba

selada air . Metode uji pendahuluan yang dilakukan pada penelitian ini termasuk

ke dalam metode kualitatif karena hanya dilakukan pengamatan. Uji pendahuluan

antioksidan akan memberika hasil positif yang ditandai dengan berubahnya warna

DPPH dari ungu tua menjadi kekuningan hal ini dapat disebabkan karena terjadi

penguarangan aktivitas dari radikal DPPH karena ditangkap oleh senyawa yang

berpotensi sebagai antioksidan sehingga terbentuk senyawa DPPH yang

tereduksi.

Pada uji ini disiapkan 3 tabung reaksi yang berisi kontrol positif yang

berisi larutan rutin dengan konsentrasi 20 µg/ml dan larutan DPPH dengan

konsentrasi 0,4 mM, kontrol negatif yang kemudian hanya berisi larutan DPPH

0,4 mM tanpa diberi larutan rutin dan sampel dan hanya ditambah dengan pelarut

metanol p.a. Kemudian untuk sampel yang berisi larutan DPPH dengan

konsentrasi 0,4 mM dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air

Gambar 5. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Keterangan : tabung A ( DPPH + metanol p.a.), tabung B ( fraksi etil asetat

ekstrak etanolik + DPPH + metanol p.a. dan tabung C ( rutin + DPPH + metanol

p.a.)

Dari ketiga perlakuan tersebut dibandingkan warna ketiga larutan

tersebut setelah didiamkan selama 30 detik. Dari hasil percobaan didapatkan

bahwa terjadi perubahan warna untuk kontrol positif yaitu dari warna ungu

menjadi kuning begitu juga dengan larutan uji yang berisi sampel dan DPPH akan

tetapi tidak terjadi perubahan warna pada kontrol negatif yang berisi larutan

DPPH dan metanol p.a. kemudian dapat disimpulkan bahwa terdapat aktivitas

antioksidan yang terdapat dalam sampel yang ditunjukkan dengan terjadinya

perubahan warna menjadi kuning seperti yang terjadi pula pada kontrol positif.

E.Hasil Optimasi Penetapan Kandungan Fenolik Total 1. Penetapan Operating Time(OT)

Pada penelitian ini dilakukan Opertaing Time dengan tujuan untuk

mengetahui waktu reaksi yang optimal antara asam galat dengan reagen

Folin-Ciocalteu. Pengukuran OT dilakukan selama 40 menit dengan melakukan

pengukuran absorbansi setiap lima menit sekali. Pada penelitian ini digunakan tiga

besar yang digunakan untuk menentukan OT. Pengukuran dilakukan pada panjang

gelombang maksimum,yaitu 760 nm.

Gambar 6. Penentuan Operating Time(OT) asam galat replikasi 2

Dari gambar 6 dapat dilihat bahwa pada menit ke dua puluh lima , semua

asam galat dengan konsentrasi yang berbeda yaitu 50, 75 , dan 100 µg/ml telah

bereaksi sempurna dengan reagen Folin-Ciocalteu pada suasana basa , hal ini

ditandai dengan absorbansi yang sudah mulai stabil pada menit ke 30, sehingga

dari data diatas dapat disimpulkan bahwa operating time untuk penentuan

kandungan asam galat dengan Folin-Ciocalteu adalah 30 menit.

2. Pengukuran panjang gelombang maksimum

Pengukuran panjang gelombang maksimum pada penelitian ini

dimaksudkan untuk menentukan panjang gelombang maksimum yang dapat

digunakan untuk pengukuran. Pengukuran panjang gelombang maksimum

Dilakukan pada tiga konsentrasi dari asam galat yang berbeda yaitu konsentrasi

kecil, sedang dan tinggi. Pengukuran panjang gelombang maksimum dilakukan

setelah Operating Time (OT) supaya didapatkan serapan yang maksimal.

Tabel I. Penentuan panjang gelombang maksimum asam galat

Konsentrasi asam galat ( µg/ml) Panjang gelombang maximum hasil scanning Panjang gelombang maximum rata-rata Panjang gelombang maximum secara teoritis

50 761

748,6 760 nm

100 742

150 743

Dari tabel diatas setelah dilakukan penentuan panjang gelombang

maksimum dari ketiga konsentrasi dari asam galat, yaitu 50, 100, dan 150 µg/ml

didapatkan rata-rata dari hasil panjang gelombang maksimum yaitu sebesar 748,6

nm.

F. Hasil Penetapan Kandungan Senyawa Fenolik Total

Penetapan kandungan senyawa fenolik total pada penelitian kali ini

menggunakan metode Folin-Ciocalteu, dimana prinsipnya adalah dengan

melakukan reaksi oksidasi dan reduksi. Reagen Folin-Ciocalteu terdiri dari

campuran fosmolibdat dan fosfotungstat yang akan mengalami reaksi reduksi

sehingga akan menghasilkan warna biru yang terbentuk sebagai hasil dari

terbentuknya senyawa komples molybdenum blue. Senyawa fenolik akan

mengalami reaksi oksidasi pada suasana basa yang berasal dari larutan natrium

Lampiran 18 . Penentuan Kandungan Senyawa Fenolik Total Persamaan regresi linier yang digunakan

y = 4,644.10-3x +0,1038 Sampel 1

Berat sampel = 5,0 mg Absorbansi = 0,401

0,401 = 4,644.10-3x +0,1038 0,2972 = 4,644.10-3x

X = 63,996 µg/ml Kandungan fenolik total

X.( v /m) = 0,0639. (0,5 ml/0,0050 g) = 6,390 mg ekivalen asam galat per gram fraksi

Sampel 2

Berat sampel = 5,0 mg Absorbansi = 0,407

0,407 = 4,644.10-3x +0.1038 0,3032 = 4,644.10-3x

X = 65,288 µg/ml Kandungan fenolik total

X. (v/m) = 0,0652.(0,5 ml/0,0050g) = 6,520 mg ekivalen asam galat per gram fraksi

Sampel 3

Berat sampel = 5,1 mg Absorbansi = 0,411

0,411 = 4,644.10-3x +0,1038 0,3072 = 4,644.10-3x

X = 66,149 µg/ml Kandungan fenolik total

X.(v/m) = 0,0661.(0,5 ml/0,0051 g) = 6,480 mg ekivalen asam galat per gram fraksi

Lampiran 19. Uji Statistika Dengan Program R a. Uji normalitas data

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “ Penetapan Kandungan Fenolik Total dan Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanolik Herba Selada Air (Nasturtium officinale R. Br) Dengan Menggunakan Metode DPPH” memiliki nama lengkap Jap Yulius Billy Soegianto ini merupakan anak dari pasangan Soegianto Karsono dan M.I Lily Budihardja dilahirkan di Semarang pada tanggal 27 Juli 1991. Pendidikan formal yang penulis jalani adalah di TK SD Kristen Debora Banjarnegara, pendidikan Sekolah Dasar di SD Kristen Debora Banjarnegara, pendidikan Sekolah Menengah Pertama di SMP N 1 Banjarnegara dan pendidikan Sekolah Menengah Atas SMA Santo Mikael Yogyakarta dan pada tahun 2009 penulis melanjutkan pendidikan Perguruan Tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakrta. Selama mengikuti kuliah di fakultas farmasi Universitas Sanata Dharma pernah mengikuti volunteer dalam pelaksanaan Kampanye Informasi Obat pada bulan November 2012.