BPW sehingga diperoleh pengenceran 1:10 10
-1
. Homogenisasi dilakukan menggunakan stomacher dengan kecepatan 300 rpm selama 30 detik.
4. Pengenceran sampel
Tabung reaksi disiapkan sebanyak 4 buah, masing-masing tabung reaksi diisi dengan 9 mL BPW. Sebanyak 1 mL pengenceran 10
-1
dari hasil homogenisasi sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung pertama yang
telah berisi 9 mL BPW sehingga diperoleh pengenceran 10
-2
kemudian dihomogenisasi. Selanjutnya dibuat pengenceran 10
-3
, 10
-4
, dan 10
-5
untuk pengujian ALT.
5. Uji Angka Lempeng Total
a.
Pembuatan media PCA
Sebanyak 236 g serbuk PCA ditimbang dan dilarutkan dalam 1350 mL aquadest steril, kemudian dipanaskan dan diaduk dengan menggunakan
hot plate and magnetic steerer diaduk hingga larutan jernih. Sterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121
o
C. b.
Pembuatan pengencer BPW
Sebanyak 20 g serbuk BPW dilarutkan dalam 1 L aquadest steril, kemudian disterilkan menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu
121
o
C. c.
Pengujian ALT
Sebanyak 1 mL dari masing-masing pengenceran dipipet ke dalam cawan petri dan dibuat duplo. Selanjutnya sebanyak 15-25 mL media PCA
45
o
± 1
o
dituangkan ke dalam cawan petri tersebut. Petri diputar ke depan
dan ke belakang atau membentuk angka delapan agar dapat tercampur merata dan didiamkan sampai memadat. Kemudian uji kontrol blanko
dibuat untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer. Pada satu cawan diisi 1 mL pengencer dan media Agar, dan pada cawan yang lain hanya diisi
media. Setelah media memadat, cawan diinkubasi pada suhu 35 - 37
o
C selama 24
– 48 jam dengan posisi terbalik. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung.
6. Uji Salmonella pada cairan jamu kunyit asam
a.
Uji pengkayaan pada media Rappaport-Vassiliadis Broth
Labu ukur disiapkan sebanyak 10 buah yang masing-masing telah diisi dengan 9 mL Rappaport-Vassiliadis Broth. Sebanyak 1 mL jamu
kunyit asam dipipet secara aseptis dan diisolasikan pada 9 mL Rappaport- Vassiliadis Broth, diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Media Rappaport-Vasiliadis Broth akan menjadi keruh bila terdapat bakteri
Salmonella spp. Uji yang sama dilakukan terhadap kontrol positif berupa kultur murni Salmonella thypi ATCC 14028. Hasil positif ditandai dengan
perubahan warna media dari biru jernih menjadi biru keruh.. b.
Isolasipenanaman Salmonella pada media selektif SSA
Pada permukaan media SSA diisolasikan 1 sengkelit dari biakan pengkayaan dengan metode streak plate 4 kuadran, dan diinkubasi pada
suhu 37
o
C selama 24 jam. Prosedur yang sama dilakukan terhadap kontrol positif yang berupa kultur murni Salmonella thypi ATCC 14028. Hasil dari
pengujian dibandingkan dengan hasil pertumbuhan kultur murni Salmnella
thypi ATCC 14028. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya koloni transparan, biasanya terdapat bintik hitam di tengah koloni tersebut.
c.
Uji konfirmasi uji biokimia Salmonella dalam jamu cekok
Satu koloni spesifik pada SSA dipilih dan digoreskan pada permukaan media NA, kemudian dilakukan uji fermentasi gula-gula, uji
sulfur, indol, motilitas, dan sitrat. Prosedur yang sama dilakukan terhadap kontrol positif. Hasil dari pengujian dibandingkan dengan hasil
pertumbuhannya berdasarkan perubahan warna yang terjadi. 1
Uji fermentasi gula-gula
a
Uji fermentasi glukosa
Satu sengkelit biakan dari SSA diinokulasikan pada media glukosa dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari oranye
kemerahan menjadi kuning. b
Uji fermentasi laktosa
Satu sengkelit biakan dari SSA diinokulasikan pada media manitol dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari oranye
kemerahan menjadi kuning. c
Uji fermentasi manitol
Satu sengkelit biakan dari SSA diinokulasikan pada media manitol dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Hasil positif
ditandai dengan adanya perubahan warna media dari oranye kemerahan menjadi kuning.
d
Uji fermentasi maltosa
Satu sengkelit biakan dari SSA diinokulasikan pada media maltose dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari oranye
kemerahan menjadi kuning. e
Uji fermentasi sakarosa
Satu sengkelit biakan dari SSA diinokulasikan pada media sakarosa dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari oranye
kemerahan menjadi kuning. 2
Uji sulfur
Satu sengkelit biakan dari SSA diinolkulasikan pada media SIM dan diinkubasikan pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya warna hitam di sepanjang bekas inokulasi.
3
Uji indol
Satu sengkelit biakan dari SSA diinokulasikan pada media SIM dengan cara ditusuk dan diinkubasikan pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Sebanyak 1 mL pereaksi indol kovacs ditambahkan ke dalam biakan,
dikocok dan didiamkan beberapa menit. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya warna merah cherry yang berbentuk cincin pada
permukaan biakan.
4
Uji motilitas
Satu sengkelit biakan dari SSA diinokulasikan pada media SIM dengan cara ditusuk dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Hasil positif ditunjukkan bila pertumbuhan mikroba tidak hanya di
bekas tusukan. 5
Uji sitrat
Satu sengkelit biakan dari SSA diinokulasikan pada media Simmon Citrate Agar dan diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24 jam. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna media dari
hijau menjadi biru. 6
Uji katalase
Satu sengkelit biakan dari SSA diinokulasikan pada gelas objek kemudian ditetesi dengan H
2
O
2
. Hasil positif ditunjukkan dengan
timbulnya buih. F.
Analisis Hasil 1.
Uji Angka Lempeng Total
a. Perhitungan jumlah koloni
Analisis hasil ALT dilakukan sesuai metode SNI 2897:2008. Jumlah koloni pada setiap seri pengenceran dihitung, kecuali cawan petri yang
berisi koloni menyebar spreader colonies. Cawan yang dipilih adalah cawan yang mempunyai jumlah koloni 25 sampai dengan 250. Perhitungan
koloni dilakukan menggunakan colony counter.
b. Interpretasi hasil
1 Cawan dengan jumlah koloni kurang dari 25. Bila cawan duplo dari
pengenceran terendah menghasilkan koloni kurang dari 25, hitung jumlah yang ada pada cawan dari setiap pengenceran. Rerata jumlah
koloni per cawan dan kalikan dengan faktor pengencerannya untuk menentukan nilai Total Plate Count TPC. Tandai nilai TPC dengan
tanda bintang Tabel 1 nomor 3 untuk menandai bahwa penghitungannya di luar 25 koloni sampai dengan 250 koloni per
cawan. 2
Cawan dengan jumlah koloni lebih dari 250. Bila jumlah koloni per cawan lebih dari 250, hitung koloni-koloni pada cawan untuk
memberikan gambaran penyebaran koloni secara representatif. Tandai TPC dengan tanda bintang untuk menandai bahwa penghitungannya di
luar 25 koloni sampai dengan 250 koloni per cawan Tabel 1 nomor 4. 3
Spreaders. Koloni yang menyebar spreaders biasanya dibagi dalam 3 bentuk:
a Rantai koloni tidak terpisah secara jelas disebabkan oleh
disintegrasi rumpun bakteri. b
Terbentuknya lapisan air antara agar dan dasar cawan. c
Terbentuknya lapisan air pada sisi atau permukaan agar. Bila cawan yang disiapkan untuk contoh lebih banyak ditumbuhi oleh
spreader seperti a, dan total area yang melebihi 25 dan 50 pertumbuhannya dilaporkan sebagai cawan spreader. Rerata jumlah
koloni dari setiap pengenceran, kemudian laporkan jumlahnya sebagai TPC Tabel 1 nomor 5. Selain 3 bentuk spreader, dapat dihitung
sebagai satu pertumbuhan koloni. Untuk tipe a bila hanya terdapat satu rantai, hitunglah sebagai koloni tunggal. Bila ada satu atau lebih
rantai yang terlihat dari sumber lain, hitung tiap sumber itu sebagai satu koloni, termasuk untuk tipe b dan c juga dihitung sebagai koloni.
Gabungkan perhitungan koloni dan perhitungan spreader untuk menghitung TPC.
4 Cawan tanpa koloni. Bila cawan petri dari semua pengenceran tidak
menghasilkan koloni, laporkan TPC sebagai kurang dari 1 kali pengenceran terendah yang digunakan. Tandai TPC dengan tanda
bintang bahwa penghitungannya di luar 25 koloni sampai dengan 250 koloni Tabel 1 nomor 6.
5 Cawan duplo, cawan yang satu dengan 25 koloni sampai dengan 250
koloni dan cawan yang lain lebih dari 250 koloni. Bila cawan yang satu menghasilkan koloni antara 25 sampai dengan 250 dan yang lain lebih
dari 250 koloni, hitung kedua cawan dalam penghitungan TPC Tabel 1 nomor 7.
6 Cawan duplo, satu cawan dari setiap pengenceran dengan 25 koloni
sampai dengan 250 koloni. Bila 1 cawan dari setiap pengenceran menghasilkan 25 koloni sampai dengan 250 koloni, dan cawan lain
kurang dari 25 koloni atau menghasilkan lebih dari 250 koloni, hitung keempat dalam penghitungan TPC Tabel 1 nomor 8.
7 Cawan duplo, dua cawan dari satu pengenceran dengan 25 koloni
sampai dengan 250 koloni, hanya 1 cawan yang lebih dari 250 koloni sampai dengan 250 koloni dan dari cawan yang lain dengan 25 sampai
dengan 250 koloni. Bila kedua cawan dari satu pengenceran penghasilkan 25 koloni sampai dengan 250 koloni, hitung keempat
cawan termasuk cawan yang kurang dari 25 atau yang lebih dari 250 koloni dalam penghitungan TPC Tabel 1 nomor 9.
c. Pelaporan hasil
1 Bulatkan angka menjadi 2 angka yang sesuai, bila angka ketiga 6 atau
di atasnya, maka angka ketiga menjadi 0 nol dan angka kedua naik 1 angka, misalnya 456 menjadi 460 4,6 x 10
2
. 2
Bila angka ketiga 4 atau di bawahnya, maka angka ketiga menjadi 0 nol dan angka kedua tetap, misalnya 454 menjadi 450 4,5 x 10
2
. 3
Bila angka ketiga 5, maka angka tersebut dapat dibulatkan menjadi 0 nol dan angka kedua adalah angka genap, misalnya 445 menjadi 440
4,4 x 10
2
. 4
Bila angka ketiganya 5, maka angka tersebut dapat dibulatkan menjadi 0 nol dan angka kedua naik 1 angka, misalnya 455 menjadi 460 4,6 x
10
2
.
Tabel I. Petunjuk penghitungan TPC
No 10
-2
10
-3
10
-4
TPC per ml
atau gram
Keterangan 1
2 3
4 5
6
1 ===
=== 175
208 16
17 190.000 bila hanya satu pengenceran
yang berada dalam batas yang sesuai, hitung jumlah
rerata dari
pengenceran tersebut.
2 ===
=== 224
225 25
30 250.000 bila ada dua pengenceran
yang berada dalam batas yang sesuai, hitung jumlah
masing-masing dari
pengenceran sebelum
merata-ratakan jumlah yang sebenarnya.
3 18
14 2
1.600 Jumlah koloni kurang dari 25 koloni pada pengenceran
terendah, hitung jumlahnya dan kalikan dengan faktor
pengencerannya dan beri tanda di luar jumlah
koloni 25 sampai dengan 250.
4 ===
=== ====
==== 523
487 5.100.0
00 Jumlah koloni lebih dari
250 koloni, hitung koloni yang dapat dihitung atau
yang mewakili beri tanda di luar jumlah koloni 25
sampai dengan 250.
5 ===
=== 245
230 35
spreader 290.000 Bila ada dua pengenceran
diantara jumlah koloni 25 sampai dengan 250, tetapi
ada spreader,
hitung jumlahnya
dan kalikan
dengan faktor pengenceran, namun untuk spreader tidak
dihitung.
6 100
Bila cawan tanpa koloni, jumlah TPC adalah kurang
dari 1 kali pengenceran terendah yang digunakan,
2. Identifikasi bakteri Salmonella
