Jenis dan Rancangan Penelitian Alat dan Instrumen Penelitian Tata Cara Analisis Hasil

27

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah.

B. Variabel dan Definisi Variabel Utama

1. Variabel utama :

a. Variabel bebas. Variabel bebas dari penelitian ini adalah variasi dosis pemberian ekstrak metanol Persea americana Mill. biji buah alpukat . Dosis ekstrak metanol Persea americana Mill. adalah sejumlah gram ekstrak metanol Persea americana Mill. tiap satuan kilogram berat badan subjek uji yang bersangkutan. b. Variabel tergantung. Variabel tergantung dari penelitian ini adalah efek hepatoprotektif ekstrak metanol Persea americana Mill. secara jangka panjang terhadap sel hati tikus terinduksi CCl 4 , ditandai dengan tolok ukur kuantitatif berupa penurunan aktifitas Alanine Aminotransferase ALT dan Aspartate Transaminase AST.

2. Variabel pengacau terkendali

Hewan uji tikus jantan galur Wistar, berat badan 150-250 gram, umur antara 2-3 bulan. a. Frekuensi pemberian ekstrak metanol Persea americana Mill. 1 kali sehari selama 6 hari berturut-turut dengan waktu pemberian yang sama. b.Cara pemberian ekstrak dilakukan secara per oral p.o. c. Bahan uji yang digunakan berupa biji Persea americana Mill. yang diperoleh dari Padang, Sumatra Barat.

3. Variabel pengacau tak terkendali

Kondisi patologis hewan uji

4. Definisi operasional

Definisi operasional yang digunakan pada penelitian ini yaitu : a. Ekstrak metanol biji Persea americana Mill. adalah ekstrak kental yang diperoleh dengan mengekstraksi serbuk kering biji Persea americana Mill. seberat 10,0 gram yang dilarutkan dalam 100 ml pelarut metanol 70 yang dikeringkan hingga bobot tetap. b. Efek hepatoprotektif adalah kemampuan ekstrak metanol biji Persea americana Mill. pada dosis tertentu dapat melindungi hepar dari hepatotoksin. c. Dosis optimum adalah dosis yang mampu memberikan efek hepatoprotektif dan daya hepatoprotektif paling optimal. d. Jangka panjang adalah penetapan lama pemejanan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. selama enam hari dan pada hari ke 7 diberi karbon tetraklorida dosis 2 mlkgBB. `

C. Subyek dan Bahan Penelitian

1. Subyek penelitian

Subyek uji yang digunakan berupa tikus jantan galur Wistar, umur 2-3 bulan dengan berkisar antara 150-250 gram, diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Bahan penelitian

a. Bahan uji adalah simplisia biji buah alpukat Persea americana Mill. yang berupa serbuk. Bahan uji diperoleh dari kawasan Sumatera Barat yang telah diserbukkan, dideterminasi serta ditetapkan kadar airnya. b. Bahan hepatotoksik adalah larutan CCl 4 E. Merck, Darmstadt, Germany yang dilarutkan dalam Olive Oil merek dagang Bartoli yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Konsentrasi karbon tetraklorida yang digunakan adalah 50 dengan dosis 2 mlkgBB. c. Bahan pelarut aquadest diperoleh dari Laboratorium Farmakologi Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. d. Bahan pengektrak serbuk biji alpukat yaitu metanol teknis PT. Brataco dengan konsentrasi 99 yang diencerkan hingga konsentrasi 70 menggunakan pengencer aquadest. e. Penetapan aktivitas ALT digunakan pereaksi siap pakai kit GPT-ALAT E. Merck, Darmstadt, Germany untuk mengukur aktivitas ALT serum. Masing-masing bahan terdiri atas dua reagen yaitu Reagen 1 dan Reagen 2. GPT-ALAT : R1 TRIS pH 7.15 140 mmolL L-Alanine 700 mmolL LDH Lactate dehydrogenase ≥2300 UL R2 2-Oxoglutarate 85 mmolL NADH 1 mmolL Pyridoxal-5-phosphate FS : Good’s buffer pH 9.6 100mmolL Pyridoxal-5-phosphate 13mmolL f. Aquabidest digunakan sebagai pencuci vitalab mikro dan juga sebagai blanko dalam pengukuran aktvitas kreatinin serum. Aquabidest ini diperoleh dari laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. g. Natrium-Carboxymethyl Cellulosa CMC-Na. CMC-Na yang digunakan dalam bentuk serbuk, diperoleh dari laboratorium Biofarmasetika Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta

D. Alat dan Instrumen Penelitian

Alat-alat yang dipakai meliputi : 1. Seperangkat alat gelas berupa bekker glass, erlenmeyer, gelas ukur, labu ukur, cawan porselen, pipet tetes, batang pengaduk Pyrek Iwaki 2. Timbangan analitik 3. Shaker 4. Oven Memmert 5. Sentrifuge 6. Vortex 7. Spuit per oral dan syringe 3 cc 8. Pipa kapiler 9. Vitalab micro Microlab 200, Merck 10. Kamera Canon 5D

E. Tata Cara Penelitian 1.

Determinasi serbuk Persea americana Mill. Determinasi serbuk biji tanaman Persea americana Mill. dilakukan dengan mencocokan ciri-ciri tanaman Persea americana Mill. dengan serbuk biji tanaman Persea Americana Mill. yang telah dideterminasi dengan menggunakan buku acuan determinasi. Determinasi dilakukan secara makroskopis termasuk organoleptis serbuk dan secara mikroskopis. Determinasi dilakukan oleh Yohanes Dwiatmaka, M.Si yang merupakan dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Pengumpulan bahan

Bahan uji yang digunakan adalah biji Persea americana Mill. yang masih segar, diperoleh dari Sumatera Barat pada bulan Januari musin penghujan.

3. Pembuatan serbuk

Biji Persea americana Mill. dicuci bersih dibawah air mengalir. Setelah bersih, biji kemudian dikering anginkan hingga biji tidak tampak basah lagi, kemudian biji Persea americana Mill. dipotong tipis-tipis dan dikeringan di dalam oven pada suhu 50 C selama 24 jam untuk mengoptimalkan proses pengeringan. Setelah kering, biji diserbukkan dan diayak dengan ayakan nomor 40. Pengayakan dilakukan agar kandungan fitokimia yang terkandung dalam biji Persea americana Mill. lebih mudah tersekstrak karena luas permukaan spesifik yang kontak dengan pelarut semakin besar.

4. Pembuatan ekstrak metanol biji Persea americana Mill.

Sebanyak 10 gram serbuk kering biji Persea americana Mill. diekstraksi dengan cara maserasi. Serbuk dilarutkan dalam 100 ml pelarut metanol 70 di dalam Erlenmeyer bersumbat kaca. Ekstraksi dilakukan pada suhu kamar. Perbandingan jumlah serbuk dan pelarut adalah 1:10. Campuran serbuk dan pelarut kemudian digojong selama 1 menit, didiamkan dalam ruangan gelap dan ditutup. Setiap harinya selama 5 hari berturut-turut pada jam yang sama dilakukan penggojogan selama 1 menit. Kemudian dilakukan penyaringan dengan kertas saring dengan bantuan pompa vakum. Ekstrak kemudian diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 70 C hingga tidak ada lagi tetesan pada rotary evaporator. Hasilnya kemudian dipindahkan ke dalam cawan porselen yang telah ditimbang bobotnya terlebih dahulu. Selanjutnya, dipekatkan dengan menggunakan penangas air pada suhu 70 C. dilakukan penimbangan setiap harinya hingga bobot ekstrak tetap selisih penimbangan 0,5 mg tiap gram zat sisa dari 2 penimbangan berturut-turut. Kemudian ekstrak disimpan di dalam desikator hingga saat akan digunakan.

5. Pembuatan larutan Natrium-Carboxy Methyl Cellulosa CMC-Na 1

Larutan CMC-Na 1 dibuat dengan cara menimbang 5,0 g CMC-Na serbuk yang telah digerus dalam mortar dan stamper terlebih dahulu. Serbuk kemudian ditaburan secara merata di permukaan 200 mL aquadest di dalam gelas kimia dan ditunggu hingga semua serbuk terbasahi, tanpa pengadukan. Setelah semua serbuk CMC-Na terbasahi maka dilakukan pengadukan hingga seluruh CMC-Na larut. Larutan CMC-Na kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 500 ml dan ditambahkan aquadest hingga batas tanda.

6. Pembuatan suspensi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill.

dalam CMC-Na 1 Suspensi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dibuat dengan konsentrasi 7. Sebanyak 3,5 g ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. ditimbang secara seksama. Kemudian dilarutkan dengan menggunakan larutan CMC-Na 1 hingga terlarut keseluruhan dan dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL dan ditambah dengan larutan CMC-Na 1 hingga batas tanda, selanjutnya digojog hingga homogen. 7. Pembuatan larutan karbon tetraklorida CCl 4 konsentrasi 50 Larutan CCl 4 dalam Olive Oil dibuat dengan cara melarutkan 25 ml CCl 4 dalam labu takar 50 ml kemudian ditambahkan dengan Olive Oil hingga tanda. Digojog hingga homogen. Pengambilan CCl 4 dilakukan dengan menggunakan pipet gondok 25 ml.

8. Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill.

Penetapan kadar air dilakukan dengan cara menimbang sebanyak 5,0 g serbuk biji Persea americana Mill. dan kemudian serbuk tersebut dimasukkan ke dalam alat moisture balance selama 15 menit pada suhu 105°C. Perhitungan kadar air berdasarkan selisih bobot sebelum serbuk dimasukkan ke dalam alat moisture balance dengan sesudah serbuk dimasukkan ke dalam alat moisture balance. Selisih bobot inilah yang merupakan kadar air dari serbuk biji Persea americana Mill.

9. Penetapan konsentrasi ekstrak pekat

Rata-rata bobot ke enam replikasi ekstrak metanol biji Persea americana Mill. kental yang telah dibuat. Bobot ekstrak = berat cawan ekstrak kental – berat cawan kosong. Rata- rata bobot ekstrak = Konsentrasi ekstrak didapat dari hasil rata-rata bobot ekstrak. Konsentrasi yang digunakan adalah konsentrasi pekat yang dapat dibuat. Pada konsentrasi yang digunakan tersebut ekstrak dapat dimasukkan dan dikeluarkan dari spuit oral . Cara pembuatannya adalah dengan melarutkan ekstrak setiap cawan dalam labu ukur 5 ml dengan pelarut yang sesuai CMC Na 1. Sehingga konsentrasi ekstrak dapat ditetapkan.

10. Uji pendahuluan

a. Penetapan dosis hepatoprotektif CCl 4 Pemilihan dosis CCl 4 dilakukan untuk mengetahui pada dosis berapa CCl 4 mampu menyebabkan kerusakan pada hati tikus yang ditandai dengan peningkatan serum ALT paling tinggi. Dosis hepatotoksik yang digunakan dalam penelitian ini berdasarkan pada hasil orientasi yang sedang dilakukan sehingga nantinya bisa didapat dosis yang mampu meningkatkan aktivitas ALT serum pada tikus bila diberikan secara per oral. b. Penetapan waktu cuplikan darah Kenaikan serum ALT akan terjadi pada waktu 24-48 jam setelah pemejanan CCl 4. Untuk mendapatkan waktu pencuplikan darah dilakukan orientasi dengan 4 kelompok perlakuan waktu. Masing-masing kelompok sejumlah 3 ekor tikus. Kelompok I diambil darah pada jm ke-0 setelah pemejanan CCl 4, kelompok II diambil darah pada jam ke-24 setelah pemejanan CCl 4 , kelompok III diambil darah pada jam ke-48 dan keompok IV diambil darah pada jam ke-72 setelah pemejanan CCl 4. Setelah pengambilan darah, darah diukur aktivitas serum ALT dan ditentukan waktu optimal pengukuran cuplikan darah berdasarkan data serum ALT. c. Penetapan lama pemejanan ekstrak metanol biji Persea americana Mill. Lama waktu pemejanan ekstrak metanol biji Persea americana Mill dilakukan selama 6 hari berturut-turut, pada hari ketujuh dipejankan senyawa hepatotoksin dan diukur aktivitas ALT-nya setelah 24 jam pemejanan senyawa hepatotoksin.

11. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji

Sejumlah tiga puluh lima ekor tikus dibagi secara acak ke dalam tujuh kelompok perlakuan masing-masing sejumlah 5 ekor. Kelompok I kontrol hepatotoksin diberi larutan CCl 4 secara intraperitonial. Kelompok II kontrol negatif diberi minyak zaitun Olive Oil dosis 3,84 gKg BB selama 6 hari berturut-turut secara intrapenitonial. Kelompok III kontrol ekstrak biji Persea americana Mill. dengan dosis 1400mgkgBB selama 6 hari berturut-turut secara intrapenitonial. Kelompok IV kontrol positif diberi Curliv ® 4,05 mlkgBB selama enam hari berturut-turut secara peroral. Kelompok V sampai dengan kelompok VII berturut-turut diberi ekstrak metanol biji Persea americana Mill dengan dosis 1400; 700; dan 350 mgkgBB selama 6 hari berturut-turut secara peroral. Kemudian pada hari ketujuh semua kelompok perlakuan diberi larutan CCl 4 dosis tertentu secara intraperitonial setelah 24 jam diambil darahnya melalui sinus orbitalis mata. Cuplikan darah diambil serumnya untuk aktivitas ALT serumnya.

12. Pembuatan serum

Darah tikus diambil melalui sinus orbitalis mata dan ditampung dalam effendrof 1,5 ml melalui dinding tabung, didiamkan selama 15 menit. Dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 menit dan diambil supernatannya serum. Supernatan ditampung dalam effendrof 1,5 mL. Serum yang belum diukur kemudian disimpan dalam lemari pembeku Freezer.

13. Penetapan aktivitas serum ALT dan serum AST

Alat yang digunakan untuk menganalisis aktivitas ALT-AST serum adalah vitalab mikro. Aktivitas enzim diukur pada panjang gelombang 340 nm, suhu 37 C dengan faktor koreksi -1745. Aktivitas serum ALT-AST dinyatakan dalam UL. Pengukuran aktivitas serum ALT-AST dilakukan di laboratorium Biokimia , Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Analisis dilakukan dengan cara sebagai berikut, 100 μL serum dicampur dengan reagen I sebanyak 1000 µL, divortex selama 5 detik. Didiamkan selama 1 menit. R eagen II ditambahkan sebanyak 250 μL, divortex 5 detik dan dibaca serapannya setelah 2 menit.

F. Tata Cara Analisis Hasil

Data aktivitas ALT diuji dengan Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui distribusi data dan analisis varian untuk melihat homogenitas varian antar kelompoknya sebagai syarat analisis parametrik. Jika data terdistribusi normal maka dilanjutkan dengan analisis variansi pola searah One Way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95 untuk mengetahui perbedaan masing-masing kelompok. Kemudian dilanjutkan dengan uji LSD untuk melihat perbedaan antar kelompok bermakna signifikan p0,05 atau tidak bermakna signifikan p0,05. Tetapi apabila distribusi tidak normal dilakukan analisis dengan Kruskal Wallis untuk mengetahui perbedaan aktivitas ALT serum antar kelompok. Kemudian dilanjutkan Mann Whitney untuk melihat perbedaan tiap kelompok. Data derajat kerusakan hati juga dianalisis sesuai prosedur diatas dengan taraf kepercayaan 95. Perhitungan persen efek hepatoprotektif terhadap hepatotoksin CCl 4 dilakukan dengan rumus : 38

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian dan besar dosis optimum hepatoprotektif ekstrak metanol air biji alpukat Persea americana Mill. pada tikus jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida dengan melihat penurunan aktivitas serum ALT dan serum AST. Pengamatan hasil penelitian ini dapat tercapai dengan penelitian meliputi determinasi tanaman biji alpukat Persea americana Mill., penetapan kadar air serbuk kering biji alpukat Persea americana Mill., penentuan dosis hepatotoksin karbon tetraklorida, penentuan waktu pencuplikan darah hewan uji, uji kontrol negatif olive oil, uji kontrol positif obat Curliv ® , uji efek hepatoprotektif ekstrak metanol air biji Persea americana Mill. dosis 1400; 700; dan 350 mgkgBB. A. Penyiapan Bahan 1. Determinasi serbuk Pada penelitian ini digunakan serbuk biji Persea americana Mill. sebagai bahan uji. Determinasi serbuk dilakukan dengan tujuan untuk membuktikan bahwa serbuk yang digunakan benar merupakan bagian biji dari tanaman Persea americana Mill. sehingga tidak terjadi kesalahan dalam penyiapan bahan yang digunakan. Determinasi dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Determinasi dilakukan dengan cara mencocokkan kesamaan ciri dari serbuk biji yang digunakan pada penelitian dengan serbuk biji Persea americana Mill. yang telah dideterminasi