BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni menggunakan metode desain faktorial dua faktor dan dua level yang bersifat eksploratif yaitu
mencari formula optimum gel anti-inflamasi ekstrak daun cocor bebek.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a.
Variabel bebas. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah komposisi gelling
agent Carbopol dan humektan gliserin.
b. Variabel tergantung. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah sifat
fisik sediaan gel daya sebar dan viskositas dan stabilitas pergeseran viskositas selama penyimpanan 4 minggu.
c. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian
adalah kecepatan dan lama pencampuran, kondisi penyimpanan, alat penelitian, habitat tumbuh, waktu panen, galur tikus, umur tikus, dan jenis
kelamin tikus.
d.
Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali dalam
penelitian ini adalah suhu ruangan, kelembaban ruangan, dan kondisi
fisiologis tikus.
2. Definisi operasional
a. Gel adalah sediaan semipadat yang mengandung zat aktif yang terpenetrasi
dalam suatu cairan. Penelitian ini menggunakan zat aktif yang berasal dari ekstrak daun cocor bebek Kalanchoe pinnata L..
b. Sediaan anti-inflamasi adalah sediaan untuk mengurangi gejala inflamasi
yang merupakan respon tubuh ketika terjadi kerusakan jaringan. c.
Ekstrak daun cocor bebek adalah hasil ekstraksi daun cocor bebek Kalanchoe pinnata L. yang diperoleh dengan cara maserasi menggunakan
cairan penyari etanol 70 kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator dan diuapkan sisa pelarutnya diatas waterbath selama 3 jam dengan
pengadukan setiap setengah jam sekali. d.
Gel anti-inflamasi ekstrak daun cocor bebek adalah sediaan semipadat mengandung ekstrak daun cocor bebek Kalanchoe pinnata L. yang
menggunakan Carbopol sebaagai gelling agent dan gliserin sebagai humektan dan bertujuan untuk mengurangi gejala inflamasi.
e. Gelling agent adalah bahan pembawa dalam sediaan gel dan berpengaruh
terhadap bentuk sediaan gel yang dihasilkan. Penelitian ini menggunakan Carbopol sebagai gelling agent. Carbopol adalah salah satu faktor yang
dioptimasi untuk memperoleh formula optimum. f.
Humektan adalah salah satu bahan yang digunakan untuk menjaga kestabilan sediaan dengan mengabsorbsi lembab dari lingkungan, mengurangi
penguapan air dari sediaan, dan menjaga kelembaban kulit. Penelitian ini
menggunakan gliserin sebagai humektan. Gliserin adalah salah satu faktor yang dioptimasi untuk memperoleh formula optimum.
g. Sifat fisik dan stabilitas fisik gel adalah parameter yang menunjukkan
kualitas fisik dan tingkat kestabilan sediaan gel. Parameter sifat fisik meliputi viskositas dan daya sebar, sedangkan parameter stabilitas meliputi
pergeseran viskositas setelah penyimpanan selama 4 minggu. h.
Viskositas adalah salah satu parameter kualitas fisik yang menunjukkan tingkat kekentalan sediaan gel.
i. Daya sebar adalah salah satu parameter kualitas fisik yang menunjukkan
kemampuan sediaan untuk dioleskan ketika diaplikasikan pada area tertentu. j.
Pergeseran viskositas adalah selisih viskositas gel anti-inflamasi ekstrak daun cocor bebek setelah penyimpanan empat minggu dengan viskositas gel
anti-inflamasi ekstrak daun cocor bebek setelah dua hari pembuatan pada suhu kamar.
k. Desain faktorial adalah suatu metode optimasi yang berfungsi untuk
mengetahui efek dominan dalam menentukan sifat fisik dan stabilitas sediaan gel. Desain faktorial digunakan untuk menentukan area komposisi
optimum Carbopol sebagai gelling agent dan gliserin sebagai humektan berdasarkan superimposed contour plot yang diprediksi sebagai komposisi
optimum gelling agent dan humektan.
l. Faktor adalah suatu besaran yang berpengaruh pada respon yang dihasilkan.
Penelitian ini menggunakan dua faktor yaitu komposisi gelling agent Carbopol dan humektan gliserin.
m. Level adalah nilai atau tetapan untuk faktor. Penelitian ini menggunakan dua
level untuk masing-masing faktor yaitu level tinggi dan level rendah. n.
Respon adalah perubahan yang dapat diamati dan dinyatakan sebagai besaran yang dapat dikuantitasikan. Respon dalam penelitian ini adalah hasil
uji sifat fisik gel yang meliputi viskositas dan daya sebar serta hasil uji stabilitas gel yang meliputi pergeseran viskositas.
o. Efek adalah perubahan respon sebagai akibat dari adanya variasi level dan
faktor. Nilainya dihitung dari selisih antara rata-rata respon yang timbul pada level tinggi dan rata-rata respon pada level rendah.
p. Countour plot adalah grafik yang berfungsi untuk memprediksi area
komposisi optimum suatu formula berdasarkan parameter kualitas sediaan gel anti-inflamasi ekstrak daun cocor bebek Kalanchoe pinnata L..
q. Countour plot superimposed adalah penggabungan grafik countour plot
masing-masing respon daya sebar dan viskositas sehingga diperoleh area optimum.
C. Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun cocor bebek, aquadest
, tikus galur Sprague Dawley umur 2-3 bulan dengan berat 100-200 gram,
NaCl, suspensi karagenan-salin 1 , Carbopol kualitas farmasetis, trietanolamin kualitas farmasetis, gliserin kualitas farmasetis, metil paraben kualitas famasetis,
etanol 70 kualitas farmasetis, dan Voltadex
®
.
D. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah maserator, alat-alat gelas cawan porselin, pipet tetes, batang pengaduk, gelas arloji, pipet volume, gelas ukur,
gelas Beaker, Erlenmeyer, labu hisap, propipet, corong Buchner, pompa vacuum, mixer
Maspion MT-1150, blender Phillip, Viskometer seri VT 04 RION- JAPAN, stopwatch, waterbath, neraca analitik, oven, vacuum rotary evaporator,
indikator pH universal pH stick, alat uji daya sebar, dan jangka sorong digital.
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi cocor bebek Kalanchoe pinnata L.
Determinasi dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Determinasi berdasarkan acuan Backer dan
van Den Brink 1963. Determinasi dilakukan dengan mencocokkan ciri morfologi tanaman dengan kunci determinasi hingga diperoleh kategori spesies
sehingga dapat diketahui kebenaran identitas tanaman.
2. Pembuatan ekstrak daun cocor bebek
a. Pengumpulan dan pembuatan serbuk daun cocor bebek. Bibit cocor bebek
diperoleh dari tempat budidaya Merapi Farma, Kaliurang, Yogyakarta. Bibit
dibudidayakan di Kebun Obat Universitas Sanata Dharma Kampus III Paingan. Daun cocor bebek dipanen pada umur tiga bulan sebelum
berbunga. Daun cocor bebek yang telah dipanen kemudian dicuci dengan air bersih dengan tujuan untuk menghilangkan pengotor yang terdapat pada
daun. Daun yang telah dicuci bersih kemudian dikeringkan dengan bantuan sinar matahari tidak langsung selama 2 hari dilanjutkan dalam almari
pengering dengan suhu 35 C hingga seluruh bagian daun mengering. Daun
yang telah kering diserbukkan dengan blender kemudian diayak dengan pengayak ukuran 40 mesh.
b. Pembuatan ekstrak daun cocor bebek. Pembuatan ekstrak mengacu pada
penelitian Nwose 2013 dengan modifikasi pelarut dan proses pemekatan. Serbuk simplisia daun cocor bebek dilakukan penyarian dengan metode
maserasi menggunakan cairan penyari yaitu etanol 70 dengan perbandingan 2:5. Perendaman dilakukan selama 48 jam pada suhu kamar.
Serbuk dan maserat dipisahkan menggunakan corong Buchner dan kertas saring dengan bantuan pompa vacuum. Bagian serbuk dilakukan penyarian
kembali menggunakan cairan penyari yang sama dan direndam selama 48 jam. Kedua hasil penyarian dicampur kemudian dipekatkan menggunakan
rotary evaporator pada suhu 55
C. Selanjutnya cairan dipindahkan ke cawan porselin untuk diuapkan sisa pelarutnya menggunakan waterbath
suhu 70 C selama 3 jam dengan pengadukan yang dilakukan setiap setengah
jam sekali.
c. Uji kuantitatif kandungan ekstrak daun cocor bebek. Uji kandungan
flavonoid ekstrak daun cocor bebek secara kuantitatif menggunakan metode spektrofotometri visibel. Pengujian dilakukan di Laboratorium Penelitian
dan Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dengan menggunakan pembanding quercetin. Pengujian diawali dengan pembuatan
kurva standar quercetin kemudian kadar flavonoid ditetapkan dengan mengukur absorbansi pada panjang gelombang 510 nm.
3. Optimasi formula gel
a. Formula. Formula yang digunakan dalam percobaan ini mengacu pada
penelitian “Formulasi dan Uji Efektivitas Gel Luka Bakar Ekstrak Daun
Cocor Bebek Kalanchoe pinnata L. pada Kelinci Oryctolagus cuniculus
” oleh Hasyim dkk. 2012 seperti terlihat dalam tabel II.
Tabel II. Formula gel acuan
Bahan Komposisi bv
Ekstrak daun cocor bebek 2,5
Carbopol 0,6
Trietanolamin 0,81
Gliserin 25
Propilenglikol 5
Metil paraben 0,18
Etanol 70 0,5
Air ad
100 Modifikasi dilakukan terhadap formula pada tabel II sehingga dihasilkan
formula sebagai berikut:
Tabel III. Formula gel hasil modifikasi
Bahan Formula
1 g Formula
A g Formula
B g Formula
AB g
Ekstrak daun cocor bebek 5
5 5
5
Carbopol 1
1,4 1
1,4 Gliserin
30 30
60 60
Trietanolamin 3
3 3
3 Metil paraben
0,36 0,36
0,36 0,36
Etanol 70 1
1 1
1 Air
130 130
130 130
Keterangan: Formula 1
: formula dengan level rendah faktor Carbopol dan gliserin Formula A
: formula dengan level tinggi faktor Carbopol dan level rendah gliserin
Formula B : formula dengan level rendah faktor Carbopol dan level tinggi
gliserin Formula AB : formula dengan level tinggi faktor Carbopol dan gliserin
Penelitian ini menggunakan 2 faktor yaitu Carbopol sebagai gelling agent dan gliserin sebagai humektan dengan menggunakan level rendah dan tinggi untuk
masing-masing faktor. Level rendah dan tinggi Carbopol ditetapkan sebesar 1-
1,4 g, sedangkan gliserin sebesar 30-60 g.
b. Pembuatan gel. Carbopol dikembangkan dalam wadah berisi aquadest.
Pengembangan Carbopol dilakukan dengan cara menaburkan Carbopol diatas aquadest
dan didiamkan selama 24 jam. Kemudian metil paraben dilarutkan menggunakan etanol 70 dan dicampur dengan Carbopol campuran 1.
Gliserin, sisa aquadest, dan ekstrak daun cocor bebek ditambahkan ke dalam campuran 1, kemudian dilakukan proses pencampuran dengan menggunakan
mixer dengan skala putar 1 selama 5 menit. Penambahan trietanolamin
dilakukan pada menit pertama setelah proses pencampuran dimulai.
4. Uji sifat fisik dan stabilitas fisik gel
a. Uji organoleptis dan pH. Uji organoleptis dilakukan terhadap penampilan
fisik sediaan gel ekstrak daun cocor bebek yang telah dihasilkan meliputi warna, bau, dan homogenitas. Pengukuran pH dilakukan dengan
menggunakan indikator pH universal pH stick. Sediaan gel dioleskan pada pH stick
kemudian warna yang dihasilkan dibandingkan dengan standar pada pH stick.
b. Uji viskositas. Pengujian viskositas gel dilakukan setelah 48 jam proses
pembuatan dan setelah penyimpanan selama 4 minggu. Masing-masing formula gel ditentukan viskositasnya dengan menggunakan alat Viscometer
Rion seri VT 04. Ukuran paddle yang digunakan adalah skala 2 karena
rentang viskositas yang diteliti antara 100 hingga 4000 d.Pa.S. Sediaan gel dimasukkan ke dalam cup sampai terisi ¾ cup. Paddle dipasang ke rotor
dengan posisi tegak lurus. Cup dipasang kemudian rotor dinyalakan. Nilai viskositas ditunjukkan oleh jarum penanda.
c. Uji daya sebar. Pengukuran daya sebar dilakukan terhadap sediaan gel
setelah 48 jam proses pembuatan. Daya sebar diukur dengan cara menimbang gel sebanyak 1 gram kemudian gel diletakkan pada bagian
tengah lempeng kaca bulat berskala. Kaca bulat dan anak timbang dengan
beban 125 gram diletakkan diatas gel kemudian didiamkan selama 1 menit dan diukur diameter sebarnya Garg dkk., 2002.
5. Uji aktivitas anti-inflamasi
a. Penyiapan hewan uji. Penelitian ini menggunakan tikus jantan galur Sprague
Dawley yang berumur 2-3 bulan dengan berat 100-200 g. Tikus diberi pra
perlakuan sebelum pengujian dengan dipuasakan selama 12 jam. b.
Pembuatan larutan NaCl 0,9 . NaCl ditimbang sebanyak 0,9 g kemudian dilarutkan dengan aquadest dalam labu ukur 100 ml.
c. Pembuatan suspensi karagenan-salin 1 . Karagenan ditimbang sebanyak
0,1 g kemudian dilarutkan dengan larutan NaCl 0,9 dalam labu ukur 10 ml. d.
Uji aktifitas anti-inflamasi. Tikus dibagi menjadi tiga kelompok yaitu kelompok kontrol positif, kontrol negatif dan kelompok perlakuan sediaan
gel ekstrak daun cocor bebek. Setiap kelompok masing-masing terdiri dari tiga ekor tikus. Semua tikus diukur tebal kakinya. Hewan uji kelompok
perlakuan diberi gel ekstrak daun cocor bebek pada telapak kaki kiri, kelompok kontrol positif diberi Voltadex
®
pada telapak kaki kiri, sedangkan kontrol negatif tidak dioleskan gel ekstrak daun cocor bebek maupun
Voltadex
®
. Satu jam setelah perlakuan, diinjeksikan pada telapak kaki kiri tiap tikus 0,5 ml suspensi karagenan-salin 1. Pengukuran ketebalan telapak
kaki tikus dilakukan dengan jangka sorong digital. Pengukuran ketebalan telapak kaki tikus selama 3 jam yang dilakukan pada menit ke 0 sebelum
dioleskan Voltadex
®
dan gel , 30, 60, 120, 180 Matthew dkk., 2013. Nilai edema tiap jam diukur dengan rumus :
Yu = Yt –Yo ...................................................................................... 1
Keterangan : Yu
: Edema kaki tikus pada waktu tertentu Yt
: Tebal kaki tikus pada waktu tertentu setelah diradangkan dengan karagenan 1
Yo : Tebal kaki tikus sebelum diradangkan dengan karagenan
1 Nilai AUC total masing-masing perlakuan dihitung dengan rumus:
∑ [ ]
................................................ 2
Keterangan : : area dibawah kurva dari jam ke-0 sampai jam ke-3
mm.jam : selisih edema telapak kaki pada jam ke-n-1 mm
: selisih edema telapak kaki pada jam ke-n mm : jam ke-n jam
: jam ke-n-1 jam Persen penghambatan inflamasi dihitung dengan rumus:
........... 3
Keterangan : :
rata – rata kontrol negatif mm.jam
: masing-masing tikus pada kelompok yang diberi
perlakuan n mm.jam Taufiq, Wahyuningtyas, dan Wahyuni, 2008.
F. Optimasi dan Analisis Data
Data sifat fisik dan stabilitas fisik gel yang diperoleh dianalisis sesuai dengan metode perhitungan desain faktorial untuk mengetahui efek dari Carbopol,
gliserin, dan interaksinya. Analisis menggunakan rancangan desain faktorial untuk menghitung koefisien b
, b
1
, b
2
, b
12
sehingga didapatkan persamaan Y = b + b
1
X
1
+ b
2
X
2
+ b
12
X
1
X
2
. Persamaan tersebut kemudian dapat dibuat countour plot sifat fisik gel anti-inflamasi ekstrak daun cocor bebek. Countour plot masing-masing respon
digabungkan sehingga diperoleh countour plot superimposed untuk mengetahui area komposisi optimal Carbopol dan gliserin, terbatas pada level yang diteliti. Analisis
data dilakukan dengan menggunakan software R 3.1.2 dengan uji two way ANOVA pada taraf kepercayaan 95. Tahapan analisis data antara lain uji normalitas data, uji
variansi dan uji ANOVA. Uji normalitas data dilakukan dengan Shapiro Wilk. Distribusi data normal jika nilai p lebih dari 0,05. Selanjutnya dilakukan uji variansi
data dengan Levene’s test untuk mengetahui homogenitas data. Jika uji variansi data
menunjukkan nilai p lebih dari 0,05 maka data memiliki kesamaan varian Rohman,
2014. Apabila data terdistribusi normal dan memiliki kesamaan varian maka dilanjutkan dengan uji ANOVA. Uji ANOVA bertujuan untuk mengetahui
signifikansi efek dari Carbopol dan gliserin serta interaksi kedua faktor sehingga dapat diketahui faktor dominan yang mempengaruhi sifat fisik dan stabilitas gel
ekstrak daun cocor bebek. Jika nilai p kurang dari 0,05 maka faktor dikatakan berpengaruh.
36
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pengumpulan dan Determinasi Tanaman
Tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah cocor bebek Kalanchoe pinnata L.. Bibit cocor bebek diperoleh dari tempat budidaya Merapi
Farma, Kaliurang, Yogyakarta. Selanjutnya bibit dibudidayakan di Kebun Obat Universitas Sanata Dharma Kampus III Paingan. Tanaman cocor bebek
dibudidayakan pada habitat yang sama bertujuan untuk meminimalkan variabel pengacau tak terkendali yang dapat disebabkan oleh berbagai faktor sehingga
kandungan daun cocor bebek seragam. Determinasi dilakukan terhadap tanaman cocor bebek yang dibudidayakan dengan tujuan untuk mendapatkan informasi tentang
kebenaran tanaman tersebut. Determinasi terhadap tanaman cocor bebek mengacu pada Backer dan van Den Brink 1963. Determinasi dilakukan dengan mencocokkan
ciri-ciri morfologi tanaman dengan kunci determinasi hingga diperoleh kategori spesies. Berdasarkan hasil determinasi yang dilakukan di Laboratorium Kebun
Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma diketahui bahwa tanaman tersebut terbukti benar adalah cocor bebek Kalanchoe pinnata L.. Hasil
determinasi tanaman cocor bebek ini dinyatakan dalam Surat Keterangan Determinasi Tanaman Lampiran 1.
Kategori