Rosanti Muchsin : Pengaruh Pemberian Monosodium Glutamate Terhadap Histologi Endometrium Mencit Mus Musculus L, 2009.
BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.3. Tempat dan Waktu
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Universitas Sumatera Utara dan Laboratorium Histologi Universitas Sumatera Utara. Penelitian dilakukan selama 3 tiga bulan, dari bulan Mei sampai dengan Juli 2009.
3.4. Bahan dan Alat Penelitian
3.4.1. Bahan Penelitian
Bahan biologis. Bahan biologis yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit betina Mus musculus L strain DD
Webster berumur 10 hari. Mencit betina merupakan hasil perbanyakan hewan koloni induk stok di Rumah Hewan Universitas Gajah Mada Yogyakarta UGM. Sebanyak 24 ekor mencit betina diperoleh dari hasil perbanyakan untuk
keperluan penelitian. Jumlah hewan uji perkelompok ditentukan dengan rumus tr–1 ≥20 Sugandi, 1994. Jika t adalah
jumlah kelompok dalam penelitian ini ada 2 kelompok, yaitu kelompok perlakuan dan kelompok kontrol dan r adalah jumlah ulangan perkelompok, maka jumlah r yang diharapkan teoritis adalah sebesar 11 ekor per kelompok.
Rosanti Muchsin : Pengaruh Pemberian Monosodium Glutamate Terhadap Histologi Endometrium Mencit Mus Musculus L, 2009.
Litter yang berasal dari induk betina, pada usia 9 hari diperiksa untuk penentuan jenis kelamin. Semua keturunan F1 jantan yang sama tanggal lahirnya dikeluarkan dari litter. Litter betina F1 yang digunakan sebagai subjek dalam penelitian.
Pada bagian badan dan ekor litter diberi tanda warna hitam untuk kelompok kontrol dan warna merah untuk kelompok perlakuan. Semua litter F1 baik yang jantan maupun yang betina tetap disusui induk sampai usia sapih 21 hari.
Bahan Kimia. Bahan kimia yang diuji pengaruhnya terhadap histologi endometrium dalam penelitian ini adalah
monosodium glutamate murni Sigma yang dilarutkan dengan aquadest. Bahan lain yang diperlukan untuk keperluan pembuatan apusan vagina dan sediaan histologi antara lain; metilen blue, buffer formalin 10, parafin pellet titik leleh 56
– 58
o
C, albumin Mayer sebagai adhesive jaringan pada permukaan gelas objek, xylol untuk hydrasi sayatan yang sudah ditempelkan pada slide, alkohol absolut, alkohol 95, 80,70, 50 untuk hidrasi sayatan dari aceton, aceton untuk
hidrasi sayatan dari air Semua bahan kimia yang akan digunakan adalah grade analitik pa grade dan diperoleh dari Merck.
Pemeliharaan Hewan Coba. Selama perlakuan, mencit ditempatkan bersama dengan induk satu induk per kandang
sampai usia sapih umur 21 hari, dalam kandang yang terbuat dari bahan plastik ukuran 30 x 20 x 10 cm, ditutup dengan kawat kasa halus. Dasar kandang dilapisi dengan sekam padi setebal 0,5 – 1 cm dan diganti setiap dua hari. Cahaya
ruangan dikontrol persis 12 jam terang pukul 06.00 sampai dengan pukul 18.00 dan 12 jam gelap pukul 18.00 sampai 26
Rosanti Muchsin : Pengaruh Pemberian Monosodium Glutamate Terhadap Histologi Endometrium Mencit Mus Musculus L, 2009.
dengan pukul 06.00, sedangkan temperatur dan kelembaban ruangan dibiarkan berada pada kisaran alamiah. Pakan pelet komersial kode 511 diperoleh dari PT. Charoen Pokphand dan minum air PAM disuplai setiap hari secara berlebih.
3.4.2. Peralatan Utama Penelitian
Alat utama yang digunakan dalam peneitian terdiri atas timbangan kasar untuk timbang BB mencit merk Ohaus USA, jarum gavage untuk memberikan msg secara oral, timbangan balance analitik dengan ketelitian 0,01 gram merk
Sartorius Bp 160 P, disecting set, kertas saring, oven membuat blok parafin, microtechnique set penyayatan sediaan histologi endometrium , water bath, object glass gelas objek , meja pemanas hot plate merk Cimarec 2 USA, cover
glass gelas penutup, mikrometer untuk mengukur ketebalan sel mukosa dan diameter pembuluh darah endometrium dan mikroskop cahaya merk olympus Japan.
3.5. Disain Penelitian
Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental yaitu true eksperimen, yang didisain mengikuti Rancangan Acak Lengkap RAL. Eksperimen terdiri atas dua kelompok, yaitu kelompok kontrol diberikan cairan aquades 0,1cc dan
Rosanti Muchsin : Pengaruh Pemberian Monosodium Glutamate Terhadap Histologi Endometrium Mencit Mus Musculus L, 2009.
kelompok perlakuan diberi MSG 6mggr BB + aquades 0,1cc, masing-masing terdiri atas 12 mencit betina. Mencit ditempatkan ke dalam kelompok secara random.
3.6. Pelaksanaan Penelitian dan Pengamatan
3.6.1. Pemberian Perlakuan Mencit betina berumur 10 hari ditimbang berat badannya dengan menggunakan timbangan kasar. Dua belas ekor
mencit yang termasuk ke dalam kelompok perlakuan diberikan MSG 6 mggr berat badan dilarutkan dengan aquabidest 0,1ml. MSG ditimbang dengan menggunakan timbangan analitik, kemudian MSG yang telah dilarutkan dengan aquadest
0,1 ml diberikan secara oral kepada mencit perlakuan dengan menggunakan jarum gavage. Sedangkan 12 ekor mencit lainnya hanya diberikan aquades dengan volume yang sama 0,1 ml. Perlakuan ini diulang kembali pada umur mencit 12,
14, 16 dan 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 hari. Mencit tetap disusui induknya hingga usia sapih. Pada usia 21 hari mencit perlakuan dan kontrol dipisahkan dari induknya.
3.6.2. Pembuatan Sediaan Histologi Endometrium
Setelah usia 31 hari mencit perlakuan dan kontrol ditimbang berat-badan nya, dilakukan vaginal swab untuk mengetahui siklus estrusnya. Kemudian dieksekusi dengan cara dislokasi leher. Mencit dieksekusi saat berada pada
Rosanti Muchsin : Pengaruh Pemberian Monosodium Glutamate Terhadap Histologi Endometrium Mencit Mus Musculus L, 2009.
masing-masing siklus estrus, yaitu 3 ekor di eksekusi pada fase proestrus, 3 ekor pada fase estrus, 3 ekor pada fase metestrus dan 3 ekor pada fase diestrus. Kemudian abdomen dibuka, diambil uterus nya dengan hati-hati dengan cara
menggunting tepat pada bagian istmus tuba fallopii kiri dan kanan yaitu bagian yang paling dekat dengan uterus, dan pada bagian ekor batas antara cervix dan uterus. Kemudian uterus dibersihkan dari seluruh ligamen yang melekat
padanya. Selanjutnya uterus dibersihkan dari darah yang masih melekat, menggunakan kertas saring dengan satu kali tekanan. Kemudian berat uterus utuh ditimbang dengan menggunakan timbangan grade analitik dan selanjutnya dipisahkan
antara tanduk uterus kiri dan kanan, kemudian segera dimasukkan kedalam botol yang berisi larutan fixative buffer formalin 10, direndam selama 12 – 24 jam Douglas W. Cromey, 2004. Botol yang berisi larutan fiksatif sebelumnya
sudah diberi label untuk kedua kelompok pada setiap fase nya dan antara uterus kiri dan kanan. Sediaan histologi endometrium dibuat sebagai berikut;
1. Jaringan uterus yang sudah dipisahkan antara tanduk kiri uterus dengan tanduk kanannya difiksasi dengan larutan
buffer formalin 10 2.
Kemudian dipotong menjadi 3 bagian, yaitu caput, corpus dan cauda. 3.
Jaringan yang sudah dipotong menjadi tiga bagian dimasukkan ke dalam cairan aceton selama 3 x 20manit. Berujuan untuk menghilangkan air yang melekat pada organ.
Rosanti Muchsin : Pengaruh Pemberian Monosodium Glutamate Terhadap Histologi Endometrium Mencit Mus Musculus L, 2009.
4. Kemudian dimasukkan ke dalam xylol selama 1 jam. Hal ini bertujuan untuk membersihkan organ dari aceton.
5. Parafin dipanaskan didalam oven
6. Organ dari xylol dimasukkan kedalam paravin oven selama 3 jam.
7. Kemudian parafin didinginkan didalam blok parafin sampai kering.
8. Setelah kering, parafin dipotong dengan menggunakan mikrotom putar setebal 5µ m, uterus kiri dipotong secara cross
sectional dan uterus kanan secara longitudinal. 9.
Hasil pemotongan dimasukkan kedalam water bath berisi aquabidest yang sudah dihangatkan sampai suhu 45°C - 50°C.
10. Objek glass diolesi dengan albumin Mayer untuk merekatkan sayatan organ ke objek glass. Dan sayatan yang berada di
water bath diambil dengan menggunakan objek glass yang sudah diolesi dengan albumin mayer tersebut. 11.
Sayatan yang sudah berada di atas objek glass dibiarkan kering selama 12 jam. 12.
Setelah kering, dilakukan pewarnaan dengan menggunakan hematoksilin eosin. Sipahutar, 2009, Arief, 2007
3.6.3. Cara Melakukan Pewarnaan
Rosanti Muchsin : Pengaruh Pemberian Monosodium Glutamate Terhadap Histologi Endometrium Mencit Mus Musculus L, 2009.
1. Slide dimasukkan kedalam cairan xylol I dengan permukaan yang mengandung sayatan menghadap kedepan,
biarkan selama 5 menit 2.
Untuk lebih membersihkan sayatan dari parafin, sayatan dipindahkan ke dalam xilol II selama 5 menit. 3.
Slide dipindahkan lagi kedalam cairan xylol : alkohol absolut dengan perbandingan 1 : 1. Hal ini bertujuan untuk larutan dari cairan 1 tidak terlalu banyak bercampur dengan larutan berikutnya.
4. Pindahkan slide kedalam larutan alkohol absolut selama 5 menit, kemudian ke alkohol 95 dan seterusnya sampai
ke alkohol 50 selama 10 menit. 5.
Pindahkan slide ke dalam akuades selama 10 menit 6.
Slide di masukkan didalam larutan pewarna hematoksilin selama 2 – 3 menit 7.
Bilas slide dengan akuades sebanyak 2 kali. 8.
Slide di pindahkan ke dalam eosin selama 30 detik 9.
Slide dipindahkan berturut-turut ke alkohol 70 sampai ke alkohol absolut dengan waktu yang sama. 10.
Slide dipinda hkan lagi ke Xilol I dan II, masing-masing selama 5 menit Sipahutar, 2009
3.6.4. Cara Melakukan Penutupan
1. Slide diangkat dari xilol II dan langsung diteteskan dengan canada balsam.
Rosanti Muchsin : Pengaruh Pemberian Monosodium Glutamate Terhadap Histologi Endometrium Mencit Mus Musculus L, 2009.
2. Kaca penutup diambil dan diletakkan diatas canada balsam secara perlahan-lahan dan dibiarkan kering Sipahutar,
2009.
3.6.5. Pengamatan Sediaan Histologi
1. Histologi endometrium berasal dari mencit usia pubertas yang dieksekusi pada saat fase pro estrus, estrus, met
estrus dan diestrus. 2.
Histologi endometrium yang diamati pada fase pro estrus berjumlah 3 ekor, fase estrus 3 ekor dan fase met estrus 3 ekor, sedangkan pada fase diestrus 3 ekor. Jumlah yang sama baik pada kelompok kontrol maupun pada kelompok
perlakuan. 3.
Tanduk uterus kiri di potong dengan cara pemotongan cross sectional, untuk mengamati ketebalan epitel endometrium, diameter pembuluh darah dan densitas kelenjar endometrium. Pengamatan dilakukan dengan
menggunakan mikrometer yang ditempelkan kedalam lensa okuler mikroskop cahaya, dengan pembesaran okuler 40x dan pembesaran objektif 40x.
Rosanti Muchsin : Pengaruh Pemberian Monosodium Glutamate Terhadap Histologi Endometrium Mencit Mus Musculus L, 2009.
4. Sedangkan tanduk kanan di potong dengan cara pemotongan longitudinal section, untuk mengamati konfigurasi
kelenjar endometrium, lokalisasi nuklear kelenjar dan kepadatan stroma. Pengamatan dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran okuler 10x dan pembesaran obyektif 40x.
5. Pengamatan dilakukan pada kedua kelompok kontrol dan perlakuan
6. Setiap tanduk uterus diamati pada 3 titik, yaitu cervical, corpus dan cauda.
7. Satu titik terdiri dari 5 sayatan
8. Satu sayatan dilakukan 4 kali pengulangan pengamatan, yaitu bagian atas, bawah, kiri dan kanan.
9. Pada setiap slide dilakukan 20 kali pengulangan pengamatan.
3.7. Analisis Data dan Pengujian Hipotesis
Semua data dipresentasikan dalam bentuk rata-rata ± simpangan baku rata-rata ± SD. Untuk mengetahui pengaruh MSG terhadap ketebalan epitel endometrum, diameter pembuluh darah, densitas kelenjar, berat uterus utuh, kepadatan
stroma, lokalisasi nuklear kelenjar dan konfigurasi kelenjar. Uji statistik yang digunakan adalah uji t-test independent dan Anova. Uji t-test independent digunakan untuk menguji perbandingan berat badan antara kelompok perlakuan dan kontrol,
perbandingan ketebalan epitel, diameter pembuluh darah, kepadatan stroma, densitas kelenjar antara kelompok perlakuan
Rosanti Muchsin : Pengaruh Pemberian Monosodium Glutamate Terhadap Histologi Endometrium Mencit Mus Musculus L, 2009.
dan kontrol tanpa memandang fase estrus, perbandingan setiap parameter dengan memandang fase estrus dan perbandingan berat uterus utuh antara kelompok perlakuan dan kontrol. Sedangkan uji anova digunakan untuk melihat perbandingan
setiap parameter pada bagian caput, corpus dan caudal. Analisa data dilakukan dengan menggunakan microsoft excel 2003. Hasil dikatakan ada perbedaan secara
signifikan jika nilai p value 0,05.
3.8. Jadwal Penelitian
