BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk penelitian non eksperimental karena tidak dilakukan manipulasi terhadap subjek penelitian.
B. Definisi Operasional
1. Penetapan kadar kuersetin dilakukan menggunakan metode kolorimetri dengan menggunakan pereaksi AlCl
3
2. Parameter validasi penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim yang digunakan adalah akurasi dan presisi.
3. Penentuan akurasi dan presisi penetapan kadar kuersetin dalam krim dilakukan dengan menambahkan larutan baku kuersetin dengan kadar tertentu ke dalam
basis krim, diekstraksi, dan diukur kadarnya dengan spektrofotometer visibel. 4. Basis krim yang digunakan adalah krim dengan komposisi yang telah
ditentukan, yaitu: asam stearat, virgin coconut oil VCO, trietanolamin TEA, cethyl alcohol, metil paraben, asam sitrat, dan air.
C. Variabel Penelitian
Variabel dalam penelitian ini adalah kadar kuersetin yang terdapat dalam sediaan krim
16
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
D. Alat dan Bahan Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: seperangkat alat spektrofotometer UV-Vis Perkin-Elmer Lambda 20, pipet mikro 0,5 – 5,0 ml
Socorec, neraca analitik merk Scaltec SBC 22 max 60210 g; d = 0,010,1 mg; e = 1 mg, waterbath, alat-alat gelas Pyrex-Germany.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku kuersetin trihidrat p.a. Sigma, etil asetat p.a. Merck, aseton p.a. Merck, HCl p.a.
Merck, asam asetat p.a. J.T. Bakker, metanol p.a. J.T. Bakker, kloroform p.a. Merck, AlCl
3
.6H
2
O p.a. Merck, heksamin farmasetis MKR, natrium sitrat farmasetis MKR, akuades, dan basis krim dengan formula sebagai berikut:
Asam stearat 4,0 g
Virgin Coconut Oil VCO
3,5 g Trietanolamin TEA
0,8 g Cethyl Alcohol
3,5 g Asam sitrat
0,5 g Metil paraben
0,25 g Air
60,0 g
E. Tata Cara Penelitian 1. Pembuatan pereaksi
a. Larutan HCl 25 dalam akuades. HCl 37 67,56 ml dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Akuades ditambahkan ke dalam labu tersebut hingga
tanda. Pembuatan larutan HCl 25 dilakukan di dalam lemari asam.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
b. Larutan heksamin 0,5 dalam akuades. Heksamin 0,5 gram dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Akuades ditambahkan ke dalam labu
tersebut hingga tanda. c. Larutan natrium sitrat 0,5 dalam akuades. Natrium sitrat 0,5 gram
dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Akuades ditambahkan ke dalam labu tersebut hingga tanda.
d. Larutan asam asetat 5 dalam metanol. Asam asetat glasial 25 ml dimasukkan ke dalam labu ukur 500 ml. Metanol ditambahkan ke dalam labu ukur
tersebut hingga tanda. e. Larutan aluminium klorida 2 dalam asam asetat 5 dalam metanol.
Aluminium klorida 2 g dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Asam asetat 5 dalam metanol 25 ml ditambahkan ke dalam labu ukur tersebut. Larutan
didegassing selama 5 menit. Asam asetat 5 dalam metanol ditambahkan ke dalam labu ukur sampai tanda.
2. Pembuatan larutan baku
a. Larutan stok kuersetin 500 ppm. Sebanyak kurang lebih 25,0 mg serbuk kuersetin ditimbang seksama dan dimasukkan dalam labu ukur 50 ml. Etil
asetat 15 ml ditambahkan ke dalam labu ukur tersebut. Larutan didegassing selama 5 menit. Etil asetat ditambahkan ke dalam labu ukur sampai tanda.
b. Larutan intermediet kuersetin 50 ppm. Larutan stok kuersetin 500 ppm 2,50 ml dimasukkan dalam labu ukur 25 ml. Larutan diencerkan dengan etil
asetat hingga tanda.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
3. Pembuatan blangko
Etil asetat 10,0 ml dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml. Setelah itu ditambahkan AlCl
3
2 dalam asam asetat 5 dalam metanol 1,0 ml dan natrium sitrat 0,5 ml. Larutan diencerkan dengan asam asetat 5 dalam metanol
sampai tanda.
4. Optimasi metode
a. Penetapan Operating time. Larutan intermediet kuersetin 50 ppm 2,0 ml dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml. AlCl
3
2 dalam asam asetat 5 dalam metanol 1,00 ml dan natrium sitrat 0,50 ml ditambahkan ke dalam labu
tersebut. Larutan diencerkan dengan asam asetat 5 dalam metanol sampai tanda. Absorbansi diukur pada panjang gelombang maksimum teoritis 428 nm
selama 60 menit. b. Penetapan panjang gelombang absorbansi maksimum. Larutan
intermediet kuersetin 50 ppm 1,50 ml; 3,00 ml; 4,00 ml dimasukkan dalam labu ukur 25 ml. Ke dalam labu ukur tersebut ditambahkan AlCl
3
2 dalam asam asetat 5 dalam metanol 1,00 ml dan natrium sitrat 0,50 ml. Larutan diencerkan
dengan asam asetat 5 dalam metanol sampai tanda. Absorbansi diukur pada menit ke-30 setelah ditambah pereaksi pada rentang panjang gelombang 400-500
nm. c. Penetapan kurva baku. Larutan intermediet kuersetin 50 ppm 1,00 ml;
1,50 ml; 2,00 ml; 2,50 ml; 3,00 ml; 3,50 ml; dan 4,00 ml dimasukkan ke dalam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
labu ukur 25 ml. AlCl
3
2 dalam asam asetat 5 dalam metanol 1,00 ml dan natrium sitrat 0,50 ml ditambahkan ke dalam labu ukur. Larutan diencerkan
dengan asam asetat 5 dalam metanol sampai tanda. Pengukuran absorbansi dilakukan pada menit ke-30 setelah ditambah pereaksi pada panjang gelombang
427,4 nm.
5. Penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim
a. Pembuatan basis krim
Tabel III. Formula basis krim
Senyawa penyusun formula basis krim
Komposisi g
Asam stearat 4,0
VCO 3,5
Cethyl alcohol 3,5
Trietanolamin 0,8
Akuades 60,0
Metil paraben 0,25
Asam sitrat 0,5 g
Asam stearat dan cethyl alcohol dilelehkan secara terpisah di atas waterbath
, kemudian dicampur dalam keadaan panas. Trietanolamin, VCO dan metil paraben ditambahkan ke dalam campuran tersebut dan diaduk hingga
merata. Akuades sebanyak 23 bagian ditambahkan ke dalam campuran dan dicampur menggunakan mikser dengan kecepatan 400 rpm selama 15 menit.
Asam sitrat dilarutkan ke dalam 16 bagian akuades, kemudian ditambahkan ke dalam campuran sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan mikser kecepatan 400
rpm selama 30 menit. Sisa akuades ditambahkan ke dalam campuran sambil diaduk dengan mixer dengan kecepatan 400 rpm.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
b. Ekstraksi kuersetin dari basis krim. Basis krim lebih kurang 20 g ditimbang seksama kemudian dimasukkan ke dalam labu alas bulat dengan
bantuan batang pengaduk. Larutan baku kuersetin 200 ppm dalam aseton 5,0 ml ditambahkan ke dalam labu alas bulat tersebut. Aseton 25 ml ditambahkan ke
dalam labu alas bulat. Larutan heksamin 0,5 1,00 ml dan larutan HCl 25 2,00 ml ditambahkan ke dalam labu alas bulat, refluks dengan pemanasan dalam
waterbath pada suhu 70°C selama 30 menit.
Setelah dihidrolisis selama 30 menit, pendingin balik dilepas kemudian aseton diuapkan menggunakan waterbath pada suhu 75°C selama 1 jam. Setelah
itu, fase air dan fase minyak dalam labu alas bulat dituang ke dalam corong pisah 100 ml. Etil asetat 15 ml ditambahkan ke dalam corong pisah tersebut. Larutan
digojog selama 30 detik dan diamkan hingga memisah selama 15 menit. Pisahkan kedua fase yang terbentuk. Fase air diekstraksi kembali dengan 15 ml etil asetat
sebanyak 2 kali. Fase etil asetat ditampung dalam beaker glass 100 ml dan diuapkan di atas waterbath. Fase etil asetat yang telah diuapkan dibiarkan hingga
dingin. Setelah dingin, fase etil asetat disaring menggunakan kertas saring dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, lalu etil asetat ditambahkan hingga tanda.
c. Tahap penetapan kadar kuersetin. Fase etil asetat 10,0 ml dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Sebanyak AlCl
3
2 dalam asam asetat 5 dalam metanol 1,00 ml dan natrium sitrat 0,50 ml ditambahkan ke dalam labu ukur
tersebut. Larutan diencerkan dengan asam asetat 5 dalam metanol sampai tanda. Absorbansi diukur pada operating time, yaitu pada menit ke-30 setelah
ditambah pereaksi pada panjang gelombang 427,4 nm.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
F. Analisis Hasil
Analisis kuantitatif yang dilakukan dalam penelitian ini adalah penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim dengan cara memasukkan nilai
absorbansi ke dalam persamaan kurva baku sehingga didapatkan kadar kuersetin dalam sediaan krim.
Analisis penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim dilakukan dengan parameter akurasi dan presisi. Akurasi dinyatakan dengan perhitungan
recovery sebagai berikut:
100 mg
terhitung kuersetin
Jumlah mg
terukur kuersetin
Jumlah ×
= recovery
Suatu metode dinyatakan memiliki akurasi yang baik jika pada kadar analit 0,1 nilai recovery berada pada rentang 75-125.Anonim, 2004.
Presisi dinyatakan dengan perhitungan koefisien variasi CV sebagai berikut
100 rata
- Rata
SD deviasi
Standar CV
× =
Suatu metode dinyatakan memiliki presisi yang baik jika pada kadar analit 0,1 nilai koefisien variansi 20 Anonim, 2004.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pemilihan Baku
Tujuan penelitian ini adalah memvalidasi metode penetapan kadar senyawa dalam sediaan krim sehingga dapat diaplikasikan untuk penetapan kadar
flavonoid dalam sediaan krim yang berisi ekstrak teh hijau. Baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah kuersetin. Pemilihan baku kuersetin didasarkan karena
kuersetin merupakan salah satu jenis flavonoid yang terdapat dalam ekstrak teh hijau. Kuersetin juga merupakan senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan
sehingga dipercaya dapat mencegah efek buruk dari sinar UV. Selain kuersetin senyawa yang banyak terdapat pada ekstrak teh hijau
adalah katekin. Kuersetin dan katekin dapat menangkap reactive oxygen species ROS yang dihasilkan akibat paparan sinar UV. Mekanisme senyawa yang
mempunyai aktivitas antioksidan adalah dengan menangkap ROS dan kemudian senyawa tersebut akan menstabilkan dirinya dengan adanya resonansi. Struktur
katekin dan kuersetin gambar 9 memiliki struktur benzen yang sama sehingga kemungkinan terjadinya resonansi adalah sama.
Kuersetin dapat digunakan sebagai baku meskipun senyawa mayor yang terdapat dalam teh hijau adalah katekin
. Pada penetapan kadar flavonoid teh hijau
senyawa yang dapat bereaksi dengan AlCl
3
bukan hanya kuersetin saja, senyawa flavonoid lain yang memiliki gugus ortohidroksi juga dapat bereaksi dengan AlCl
3
23
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Kategori