Desain penelitian Lokasi dan Waktu Penelitian Alur Penelitian Pengolahan dan Analisis Data

33

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1. Desain penelitian

Penelitian ini adalah penelitian eksperimental.

3.2. Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada Februari hingga Agustus 2014 di Laboratorium Penelitian 1, Laboratorium Farmakognosi dan Fitofarmaka serta Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.3. Populasi dan Sampel

3.3.1. Populasi

Populasi pada penelitian ini adalah larva Artemia salina Leach.

3.3.2. Sampel

3.3.2.1. Kriteria Inklusi

Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah larva Artemia salina Leach yang berusia 48 jam.

3.3.2.2. Kriteria Ekslusi

Kriteria ekslusi pada penelitian ini adalah larva Artemia salina Leach yang tidak menunjukkan aktivitas pergerakan sebelum perlakuan.

3.3.2.3. Besar Sampel

Jumlah larva Artemia salina Leach yang digunakan adalah 10 larva untuk setiap konsentrasi ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. Pada penelitian ini terdapat empat konsentrasi dan satu kontrol negatif. Kemudian dilakukan tiga kali replikasi untuk setiap konsentrasi dan kontrol negatif. Jadi, jumlah total sampel yang diperlukan adalah 150 larva Artemia salina Leach untuk setiap kali perlakuan.

3.3.2.4. Cara Pengambilan Sampel

Cara pengambilan sampel dengan purposive random sampling terhadap larva Artemia salina Leach karena anggota populasi telah bersifat homogen. Hal ini berarti sampel larva Artemia salina Leach dengan jenis 34 dan cara penyediaan yang sama memiliki kesempatan yang sama untuk diseleksi sebagai sampel. [4]

3.4. Alat dan Bahan Penelitian

3.4.1. Alat Penelitian

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah aerator, aluminium foil, baskom kecil, batang pengaduk, bejana kaca maserasi, cawan penguap, corong kaca, digital colony counter, erlenmeyer, gelas beker, gunting, hot plate stirrer, labu ukur, lakban hitam, lampu, mikropipet, neraca analitik, oven, pH indicator paper, pipet tetes, tabung reaksi, spatula, refrigerator, rotary evaporator, sterofoam, wadah plastik dan well plate. 3.4.2. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah air laut, aquades, kertas saring, pelarut metanol, serbuk simplisia daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. dan telur Artemia salina Leach.

3.5. Cara Kerja Penelitian

3.5.1. Determinasi Tanaman dan Proses Pembuatan Simplisia

Determinasi tanaman dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor Lampiran 2. Penyiapan daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. dilakukan dengan memetik satu per satu daun muda dan daun tua yang diperoleh dari kebun rumah warga di daerah Ciputat hingga mencapai 6 kg, kemudian daun dipisahkan dari kotoran bahan asing. Pencucian dan perajangan simplisia hingga menjadi 1 kg serbuk simplisia halus serta sortasi kering dan pengepakan dilakukan di Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik Balitro, Bogor. Selanjutnya serbuk simplisia disimpan pada suhu kamar 15- 30°C. 3.5.2. Ekstraksi Daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. Dengan Metode Maserasi Ekstraksi serbuk simplisia halus daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. menggunakan pelarut metanol dilakukan dengan cara maserasi. Maserasi dilakukan sebanyak 5 kali atau hingga warna pelarut menjadi agak pudar. Sebanyak 1 kg serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana kaca 35 maserasi, lalu direndam menggunakan pelarut metanol yang telah di destilasi dengan rotatory evaporator. Dilakukan beberapa kali pengadukan dan didiamkan selama 24 jam. [34] Setelah 24 jam, rendaman disaring menggunakan kertas saring sehingga diperoleh filtrat maserat yang terpisah dari ampasnya. Kemudian filtrat dipekatkan menggunakan rotary evaporator pada suhu 45°C sehingga diperoleh ekstrak kental metanol daun Phaleria macrocarpa. Ekstrak kental dituang ke dalam cawan penguap dan diuapkan di dalam oven, lalu ditimbang menggunakan neraca analitik. Ampas hasil ekstraksi di remaserasi sehingga diperoleh filtrat ke-2, dst. [37] Ekstrak kental metanol daun Phaleria macrocarpa yang diperoleh dari 5 kali proses maserasi sebanyak 169,7650 g.

3.5.3. Penyiapan Larva Artemia salina Leach

Penetasan telur Artemia salina Leach dilakukan dalam wadah plastik berisi air laut yang dipasang aerator. [34] Wadah plastik terbagi menjadi dua ruang, yaitu ruang gelap dan ruang terang yang dipisahkan oleh sekat. Sekat terbuat dari sterofoam yang dibagian bawahnya dibuat lubang dengan diameter 1 cm untuk jalan keluar telur yang telah menetas menuju ruang sebelahnya. Sebanyak 1 L air laut terlebih dahulu diukur pH-nya menggunakan pH indicator paper, diperoleh pH 8-9. [4] Air laut dimasukkan ke dalam wadah plastik hingga lubang pada sterofoam terendam. Kemudian 1 g telur Artemia salina dimasukkan ke dalam satu ruang, lalu sekeliling ruang tersebut ditutup menggunakan aluminium foil dan lakban hitam. Ruang lainnya dibiarkan terbuka dan disinari lampu selama 48 jam. Setelah 24 jam, telur akan menetas menjadi larva dan bergerak menuju ruang terang. Larva yang berusia 24 jam dipindahkan ke dalam wadah plastik lain hingga berusia 48 jam dan dipasang aerator. Larva yang berusia 48 jam digunakan sebagai hewan uji.

3.5.4. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak yang Akan Diuji

Uji orientasi trial dilakukan terlebih dahulu dengan memilih rentang dosis 10-90 yang mematikan hewan uji. Setelah dilakukan uji orientasi, diperoleh konsentrasi larutan uji yang digunakan yaitu 35 ppm, 25 ppm, 10 ppm dan 5 ppm. Ekstrak kental metanol daun Phaleria macrocarpa 36 ditimbang menggunakan neraca analitik hingga mencapai 2000 mg, lalu dilakukan pengenceran dengan aquades hingga mencapai 100 ml. Larutan uji dihomogenkan menggunakan hot plate stirrer. Kemudian membuat larutan induk dengan konsentrasi 20000 ppm. Selanjutnya dilakukan pengenceran untuk membuat larutan uji dengan konsentrasi 35 ppm, 25 ppm, 10 ppm dan 5 ppm menggunakan rumus V 1 M 1 =V 2 M 2 . Setiap larutan uji dilakukan tiga kali replikasi.

3.5.5. Uji Toksisitas Akut Dengan Metode BSLT

Pada masing-masing well plate dimasukkan 1 ml larutan uji dengan konsentrasi 35 ppm, 25 ppm, 10 ppm dan 5 ppm, lalu 10 larva Artemia salina dimasukkan ke dalam well plate bersama 1 ml air laut menggunakan mikropipet. Kemudian diperoleh konsentrasi ekstrak pada well plate yang berisi larva Artemia salina yaitu 17,5 ppm, 12,5 ppm, 5 ppm dan 2,5 ppm karena karena adanya penambahan 1 ml air laut pada larutan uji sehingga konsentrasi berubah menjadi setengah kalinya. Sedangkan kontrol negatif hanya well plate yang berisi 2 ml air laut dan 10 larva Artemia salina tanpa penambahan larutan uji. Kemudian didiamkan selama 24 jam dan masing- masing well plate dihitung total larva yang mati tidak ada gerakan yang terdeteksi selama 10 detik pengamatan menggunakan digital colony counter atau dibawah penerangan lampu. Dilakukan tiga kali replikasi pada setiap konsentrasi. 37

3.6. Alur Penelitian

Determinasi tanaman 1 kg serbuk halus simplisia daun Phaleria macrocarpa 5 kali maserasi dengan pelarut metanol yang telah di destilasi 169,7650 g ekstrak kental metanol daun Phaleria macrocarpa 6 kg daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. Larutan induk konsentrasi 20000 ppm ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa Larutan uji konsentrasi 35 ppm, 25 ppm, 10 ppm, dan 5 ppm 1 ml larutan uji dimasukkan ke dalam well plate dengan tiga kali replikasi 10 larva Artemia salina Leach berusia 48 jam dan 1 ml air laut dimasukkan ke dalam setiap well Total larva yang mati dalam setiap well plate dihitung setelah 24 jam Persentase kematian larva dihitung pada setiap konsentrasi Nilai LC 50 dihitung menggunakan analisis probit Uji orientasi dengan rentang dosis 10-90 yang mematikan hewan uji Pengenceran 2000 mg ekstrak kental metanol daun Phaleria macrocarpa dengan aquades hingga mencapai 100 ml 38

3.7. Pengolahan dan Analisis Data

Nilai LC 50 dapat ditentukan dengan cara menggunakan grafik probit log konsentrasi, perhitungan secara matematik [30] atau aplikasi seperti Microsoft Office Excel dan SPSS. [4] Langkah perhitungan nilai LC 50 berdasarkan analisis probit, yaitu: [27] a. Memiliki tabel probit Lampiran 4. b. Menentukan nilai probit dari persen kematian tiap kelompok hewan uji. c. Menentukan log dosis tiap-tiap kelompok. d. Menentukan persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit dengan log dosis, Y = mX + b. e. Memasukkan nilai 5 probit dari 50 kematian hewan uji pada persamaan garis lurus pada nilai Y. Nilai LC 50 dihitung dari nilai anti log X pada saat Y = 5. Keterangan:  Y: Variabel terikat  m: Slope = ∑X∑Y - n∑XY ∑X 2 – n∑X 2  X: Variabel bebas  b: Intercept = ∑X∑XY - ∑X 2 ∑Y ∑X 2 - n∑X 2 Mortalitas larva Artemia salina dihitung menggunakan rumus: [31] Tingkat kematian = Kematian larva x 100 Total larva 39 39

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

2.4. Determinasi Tanaman dan Proses Pembuatan Simplisia

Penelitian ini menggunakan sebanyak 6 kg daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. yang diperoleh dari kebun rumah warga di daerah Ciputat dengan cara memetik satu per satu daun muda dan daun tua. Hal ini dapat mempengaruhi mutu simplisia karena usia tanaman yang diproses tidak sama, sumber simplisia diperoleh bukan dari hasil budidaya dan tempat tumbuh yang berbeda kualitas tanah, kadar air, sinar matahari sehingga menyebabkan perbedaan kandungan senyawa aktif. [28] Selanjutnya dilakukan determinasi di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor untuk mengidentifikasi suku dan spesies tanaman yang akan diteliti, [5] sehingga menghindari adanya kesalahan dalam pengambilan tanaman. [4] Daun yang sudah dipisahkan dari kotoran bahan asing, selanjutnya dibawa ke Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik Balitro, Bogor dan diperoleh 1 kg serbuk simplisia halus sehingga proses ekstraksi semakin efektif dan efisien. [29] Semakin halus simplisia maka semakin luas permukaan yang kontak dengan cairan penyari sehingga kandungan kimia yang terlarut dalam proses penyarian lebih banyak dan penyarian berlangsung lebih sempurna. [42] Selanjutnya serbuk simplisia disimpan pada suhu kamar 15-30°C agar mutunya tidak berubah. [28] 2.5. Ekstraksi Daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. Dengan Metode Maserasi Penelitian ini menggunakan metode ekstraksi dengan cara maserasi. Metode maserasi dipilih karena merupakan cara penyarian yang sederhana dengan menggunakan peralatan yang sederhana dan tanpa adanya tahap pemanasan sehingga menghindari terjadinya kerusakan kandungan senyawa aktif pada ekstrak. [37] Kekurangan metode maserasi yaitu waktu untuk mengekstraksi sampel cukup lama