33
3.10 Pembuatan Larutan Uji Kombinasi Ekstrak Etanol Daun Sirih Dengan Amoksisilin
3.10.1 Pembuatan larutan uji kombinasi ekstrak etanol daun sirih dengan Amoksisilin terhadap bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus
aureus.
Ekstrak etanol daun sirih ditimbang 200 mg dilarutkan dengan dimetil sulfoksida DMSO hingga 10 mL maka konsentrasi ekstrak etanol daun sirih 20
mgmL kemudian dibuat pengenceran selanjutnya sampai diperoleh ekstrak etanol dengan konsentrasi 16; 12; 8; 4 mgmL. Ditimbang 20 mg amoksisilin dilarutkan
dengan dimetil sulfoksida DMSO hingga 10 mL maka konsentrasi amoksisilin 2000 µgmL kemudian diambil 0,1 mL dengan menggunakan pipet mikro
dimasukkan kedalam vial, dicukupkan dengan 10 mL dimetil sulfoksida DMSO hingga diperoleh konsentrasi amoksisilin 20 µgmL kemudian dibuat pengenceran
selanjutnya sampai diperoleh amoksisilin dengan konsentrasi 18; 16; 12; 8; 4 mgmL.
Dipipet 0,5 mL amoksisilin 4; 8; 12; 18; 20 µgmL dimasukkan kedalam vial lalu ditambahkan 0,5 mL ekstrak etanol daun sirih dengan konsentrasi hambat
minimum KHM. Lalu dilakukan cara yang sama dipipet 0,5 mL ekstrak etanol daun sirih 4; 8; 12; 18; 20 mgmL dimasukkan kedalam vial lalu ditambahkan 0,5
mL amoksisilin dengan konsentrasi hambat minimum KHM.
3.11 Sterilisasi Alat
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini, disterilkan
Universitas Sumatera Utara
34
terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan di dalam oven pada suhu 170°C selama 1 jam. Media disterilkan diautoklaf pada suhu 121°C selama
15 menit. Jarum ose dan pinset dengan nyala Bunsen Lay,1994.
3.12 Pembuatan Media 3.12.1 Pembuatan media nutrient agar NA
Komposisi: Lab-
Lemco’ powder 1,0 Yeast extract
2,0 Peptone
5,0 Sodium chloride
5,0 Agar
15,0 Cara Pembuatan:
Sebanyak 28 g nutrient agar NA dimasukkan kedalam Erlenmeyer tambahkan air suling 1000 mL, lalu dipanaskan sampai larut sempurna.
Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit Oxoid, 1982.
3.12.2 Pembuatan nutrient broth NB
Komposisi: Lab-
Lemco’ powder 1,0 Yeast extract
2,0 Peptone
5,0 Sodium chloride
5,0 Cara pembuatan:
Ditimbang sebanyak 13 g serbuk nutrient broth dilarutkan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000
mL, dipanaskan sampai semua bahan larut sempurna. Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit Oxoid, 1982.
Universitas Sumatera Utara
35
3.12.3 Pembuatan agar miring
Dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril 3 mL NA steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai membeku pada posisi membentuk sudut 45
, kemudian tabung disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 5
C Lay, 1994.
3.13 Pembiakan Bakteri 3.13.1
Pembuatan stok kultur bakteri 3.13.1.1
Bakteri Staphylococcus aureus
Satu koloni bakteri Staphylococcus aureus diambil dengan menggunakan jarum ose steril lalu ditanamkan pada media nutrient agar NA miring dengan
cara menggores, setelah itu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 35±1°C selama 18-24 jam Ditjen POM., 1995.
3.13.1.2 Bakteri Escherichia coli
Satu koloni bakteri Escherichia coli diambil denga menggunakan jjarum ose steril lalu ditanamkan pada media nutrient agar NA miring dengan cara
menggores, setelah itu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 35±1°C selama 18- 24 jam Ditjen POM., 1995.
3.13.2 Pembuatan inokulum bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia
coli
Koloni bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli diambil dari stok kultur menggunakan jarum ose steril kemudian disuspensikan kedalam 10
mL media nutrient broth NB steril lalu diinkubasikan pada suhu 35±2 C sampai
didapat kekeruhan dengan transmitan 25 menggunakan alat spektrofotometer UV panjang gelombang 580 nm Ditjen POM., 1995.
Universitas Sumatera Utara
36
3.14 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Sirih terhadap
bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan terhadap ekstrak etanol daun sirih dengan berbagai konsentrasi. Pengujian ini dilakukan dengan metode difusi agar
menggunakan pencadang kertas. Sebanyak 0,1 inokulum dimasukkan ke dalam cawan petri steril, setelah
itu dituang media nutrient agar sebanyak 20 mL dengan suhu 45-50°C, selanjutnya cawan digoyang di atas pemukaan meja agar media dan suspensi
bakteri tercampur rata dan dibiarkan memadat. Pada media yang telah padat diletakkan beberapa pencadang kertas yang telah direndam ekstrak etanol daun
sirih dengan berbagai konsentrasi, kemudian diinkubasi pada suhu 35±1°C selama 18-24 jam. Lalu diukur diameter zona hambatan pertumbuhan bakteri di sekitar
pencadang dengan menggunakan jangka sorong Ditjen POM., 1995.
3.15 Pengujian Aktivitas Antibakteri dengan Amoksisilin terhadap bakteri
Kategori