ditambahkan 3 ml NaOH 1 N vortex dan dalam waktu 5 menit harus sudah ditambahkan 1 ml OPT 1 lalu divortex dan dibiarkan selama 4 menit.
Campuran tersebut selanjutnya ditambahkan H
3
P0
4
3 N dan divortex. Sampel sesegera mungkin dibaca dengan alat spektrofotometer. Nilai konsentrasi dan
fluorosensi dari larutan standar dimasukkan dalam program regresi linier. Nilai fluorosensi contoh dimasukkan ke dalam persamaan regresi standar y= a + bx,
dimana y= fluorosensi contoh, a = intercept, b= slope dan x = konsentrasi contoh yang akan dihitung. Konsentrasi histamin dihitung dengan rumus:
x sampel
bobot fp
x b
a -
IU ppm
histamin i
Konsentras =
Keterangan: IU = intensitas unit
a = intercept b = slope
x = bobot sampel g fp = faktor pengenceran
3.4.2. Analisis mikrobiologi a Total mikroba
Total Plate Count TPC Fardiaz 1993
Analisis TPC bertujuan untuk menentukan secara kuantitatif jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada media Plate Count Agar PCA. Prosedur
kerjanya adalah sebagai berikut: sebanyak 1 ml contoh dilarutkan ke dalam 9 ml larutan garam fisiologis steril sehingga didapatkan pengenceran 10
-1
. Larutan tersebut dipipet 1 ml, kemudian dimasukkan ke dalam botol yang berisi 9 ml
larutan fisiologis steril untuk mendapatkan pengenceran 10
-2
, demikian seterusnya sampai pengenceran 10
-5
. Masing-masing pengenceran dipipet 1 ml dan
dipindahkan ke dalam cawan petri steril, selanjutnya setiap pengenceran dipindahkan ke dalam 2 cawan petri steril duplo. Kemudian ke dalam setiap
cawan petri ditambahkan 15 ml media Plate Count Agar PCA dan cawan petri digoyang supaya media benar-benar merata dan setelah media membeku, cawan
petri disimpan dengan posisi terbalik di dalam inkubator pada suhu 37 °C selama 48 jam.
Cara perhitungan hasil analisis TPC sebagai berikut: cawan yang dipilih dan dihitung jumlah bakterinya adalah yang mengandung koloni antara
30-300. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari 2 angka, yaitu angka pertama dan angka kedua menghasilkan koloni kurang dari 30, maka jumlah koloni yang
dihitung hanya pada pengenceran yang terendah. Jika semua pengenceran menghasilkan lebih dari 300 koloni, maka hanya jumlah koloni tertinggi yang
dihitung. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni antara 30-300 koloni dan perbandingan hasil tertinggi dan terendah dari kedua
pengenceran tersebut kurang dari atau sama dengan dua, maka kedua nilai tersebut dirata-ratakan dengan memperhitungkan pengencerannya.
Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar dari atau sama dengan
dua maka yang dilaporkan hanya hasil yang terkecil. Apabila menggunakan dua cawan petri duplo per pengenceran, maka data yang diambil adalah dari kedua
cawan petri tersebut. Perhitungan jumlah koloni menggunakan rumus sebagai berikut:
b Total kapang Fardiaz 1993
Prosedur analisis total kapang sama dengan prosedur analisis pada TPC, hanya media yang digunakan untuk total kapang adalah Potatoes Dextro Agar
PDA. c
Escherichia coli SNI 01-2332.1- 2006
Prinsip kerja dari pengujian Escherichia coli adalah menumbuhkan bakteri dalam suatu media cair dan perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah
tabung yang positif setelah diinkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Prosedur kerja pengujian E. coli adalah sebagai berikut:
Faktor pengeceran Total mikroba Cfug = Jumlah koloni per cawan
1 x
1. Preparasi contoh Prosedur kerjanya sebagai berikut: contoh sebanyak 25 ml yang akan
diuji dipipet, kemudian dimasukkan ke dalam wadah plastik steril dan ditambahkan 225 ml larutan Butterfield’s Phosphatase Buffered BPB,
selanjutnya dihomogenkan selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan dengan pengenceran 10
-1
. 2. Uji pendugaan coliform
Pertama-tama disiapkan pengenceran 10
-2
dengan cara melarutkan 1 ml larutan 10
-1
ke dalam 9 ml larutan pengencer BPP. Pengenceran dilakukan sesuai dengan pendugaan kepadatan populasi contoh dan setiap pengenceran dilakukan
pengocokan minimal 25 kali. Sampel selanjutnya dipindahkan dengan
menggunakan pipet steril sebanyak 1 ml larutan dari setiap pengenceran ke dalam 3 seri atau 5 seri tabung Lauryl Tryptose Broth LTB yang berisi tabung durham
selanjutnya diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35 C. Gas yang terbentuk
positif setelah inkubasi 24 jam diperhatikan, selanjutnya tabung-tabung yang negatif tidak adanya gas diinkubasikan kembali selama 24 jam. Tabung positif
ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham. 3. Uji penegasan coliform
Tabung-tabung Lauryl Tryptose Broth
LTB yang positif diinokulasikan kedalam tabung-tabung Brilliant Green Lactose Bile Broth BGLBB yang berisi
tabung durham dengan menggunakan jarum ose. Tabung-tabung BGLBB yang telah diinokulasi kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35
C. Tabung- tabung BGLBB yang menghasilkan gas diperiksa dan dipisahkan. Tabung positif
ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham. Jumlah tabung-tabung BGLBB yang positif ditentukan berdasarkan Angka Paling Memungkinkan
APM dan dinyatakan sebagai APMg coliform. 4. Uji pendugaan E. coli
Tabung LTB yang positif diinokulasi ke tabung-tabung Escherichia coli Broth
ECB yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose. ECB kemudian diinkubasi dalam waterbath selama 48 jam pada suhu 45
C. Waterbath
harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi dari cairan yang ada dalam tabung yang akan diinkubasi. Tabung-tabung ECB yang menghasilkan
gas selama 24 jam diperiksa, dan jika negatif maka diinkubasi kembali sampai 48 jam. Tabung yang positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung
durham. Jumlah tabung-tabung BGLBB yang positif ditentukan berdasarkan Angka Paling Memungkinkan APM dan dinyatakan sebagai APMg faecal
coliform. 5. Uji penegasan E. coli
Tabung-tabung ECB yang positif digoreskan ke Levine’s Eosin Methylene Blue Agar
L-EMBA menggunakan jarum ose, lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35
C. Koloni E. coli terduga memberikan ciri yang khas yaitu hitam pada bagian tengah tanpa hijau metalik. Koloni yang diduga E. coli
kemudian diambil lebih dari satu koloni dari masing-masing cawan L-EMB lalu digoreskan ke media Plate Count Agar PCA miring dengan menggunakan jarum
tanam, selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 C.
6. Uji morfologi Uji morfologi dilakukan dengan cara pewarnaan Gram dari setiap koloni
yang diduga sebagai E. coli. Biakancontoh diambil dari PCA yang telah diinkubasi selama 24 jam kemudian dilanjutkan dengan pengamatan Gram
bakteri menggunakan mikroskop sehingga dapat diketahui bahwa E. coli termasuk bakteri Gram-negatif, berbentuk batang pendek.
d Salmonella SNI 01-2332.2- 2006
Prinsip kerja dalam pengujian Salmonella adalah contoh yang diuji ditumbuhkan terlebih dahulu pada media pengkayaan kemudian dideteksi dengan
menumbuhkannya pada media agar selektif. Metode ini didasarkan pada pengujian dengan menggunakan media pengkayaan. Koloni-koloni yang diduga
Salmonella suspect colonies pada media selektif diisolasi dan dilanjutkan
dengan konfirmasi melalui uji biokimia dan uji serologi untuk meyakinkan ada atau tidaknya bakteri Salmonella. Prosedur kerja pengujian Salmonella adalah
sebagai berikut :
1. Prapengkayaan Sampel sebanyak 25 g atau contoh cair sebanyak 25 ml dari contoh yang
akan diuji, kemudian dimasukkan dalam wadah plastik steril dan ditambahkan 225 ml larutan Lactose Broth LB. Contoh kemudian dihomogenkan selama 2
menit untuk dianalisis dan secara aseptis larutan contoh dipindahkan dalam wadah steril yang sesuai dan dibiarkan pada suhu ruang selama 60 menit dengan wadah
tertutup. Sampel dikocok perlahan-lahan dan bila perlu nilai pH ditetapkan sampai 6,6, kemudian dikocok secara merata dan tutup wadahnya dikendurkan
secukupnya. Sampel kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 C.
2. Pengkayaan Contoh dipindahkan sebanyak 0,1 ml kedalam 10 ml Rappaport-
Vassilladis RV medium dan 1 ml larutan contoh kedalam 10 ml Tetrathionate
Broth TTB. Media pengkayaan selektif kemudian diinkubasi selama 24 jam
pada suhu 43 C waterbath.
3. Isolasi Salmonella Tabung medium RV dan TTB yang sudah diinkubasi dihomogenkan
dengan vortex dan menggunakan jarum loop, kemudian digoreskan RV yang telah diinkubasi ke dalam media pertumbuhan Salmonella yaitu Hectoen Enteric Agar
HEA, Xylose Lysine Desoxycholate Agar XLDA dan Bismuth Sulfit Agar BSA. Hal yang sama dilakukan untuk contoh yang sudah diinkubasi dalam
media TTB kemudian digoreskan pada media HEA, XLDA dan BSA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35
C. 4. Pengamatan morfologi koloni Salmonella yang khas typical
Koloni Salmonella
dari masing-masing media agar selektif setelah diinkubasi 24 jam kemudian diambil 2 atau lebih koloni. Koloni-koloni
Salmonella yang khas adalah pada HEA, koloni berwarna hijau kebiruan sampai
biru dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur Salmonella membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni berwarna hitam.
Media XLDA, koloni berwarna merah jambu pink tanpa inti hitam. Kultur Salmonella
umumnya membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir
seluruh koloni terlihat berwarna hitam, sementara pada media BSA, koloni coklat abu-abu, hitam, kadang-kadang metalik. Biasanya media di sekitar koloni pada
awalnya berwarna coklat kemudian berubah menjadi hitam haloeffect dengan makin lamanya waktu inkubasi. Apabila koloni yang khas tumbuh pada BSA
setelah 24 jam inkubasi, maka diambil 2 koloni atau lebih dan diinkubasi kembali media BSA selama 24 jam. Pengambilan koloni pada media BSA ini dilakukan
jika ada koloni yang tumbuh pada media tersebut.
3.4.3 Uji organoleptik
