3.3.3 Analisis asam amino AOAC 2005
Komposisi asam amino ditentukan dengan menggunakan HPLC. Perangkat HPLC harus dibilas terlebih dahulu dengan eluen yang akan digunakan
selama 2-3 jam. Begitu pula dengan syringe yang akan digunakan dibilas dengan akuades sampai syringe benar-benar bersih. Analisis asam amino dengan
menggunakan HPLC terdiri dari empat tahap, yaitu: tahap pembuatan hidrolisat protein, tahap pengeringan, tahap derivatisasi dan tahap injeksi serta analisis asam
amino. a.
Tahap pembuatan hidrolisat protein Preparasi sampel, yaitu tahap pembuatan hidrolisat protein, sampel
ditimbang, sebanyak 0,1 gram dan dihancurkan. Sampel yang telah hancur ditambahkan HCl 6 N sebanyak 10 ml yang kemudian dipanaskan dalam
oven pada suhu 100
o
C selama 24 jam. Pemanasan dilakukan untuk mempercepat reaksi hidrolisis.
b. Tahap pengeringan
Sampel disaring dengan kertas saring milipore. Penyaringan ini bertujuan agar larutan yang dihasilkan benar-benar bersih, terpisah dari padatan. Hasil
saringan diambil sebanyak 30 mikroliter dan ditambahkan dengan 30 mikroliter larutan pengering. Larutan pengering dibuat dari campuran
methanol, pikotiosianat dan trietilamin dengan perbandingan 4:4:3. c.
Tahap derivatisasi Larutan derivatisasi sebanyak 30 mikroliter ditambahkan pada hasil
pengeringan, larutan derivatisasi dibuat dari campuran metanol, natrium asetat dan trietilamin dengan perbandingan 3:3:4. Proses derivatisasi
dilakukan agar detektor mudah untuk mendeteksi senyawa yang ada pada sampel, selanjutnya dilakukan pengenceran dengan cara menambahkan 20 ml
asetonitrit 60 atau buffer natrium asetat 1M, lalu dibiarkan selama 20 menit.
d. Tahap injeksi ke HPLC
Hasil saringan diambil sebanyak 40 mikroliter untuk diinjeksikan ke dalam HPLC. Perhitungan konsentrasi asam amino yang ada pada bahan dilakukan
dengan pembuatan kromatogram standar dengan menggunakan asam amino
yang telah siap dipakai yang mengalami perlakuan yang sama dengan sampel. Kandungan asam amino pada bahan dapat dihitung dengan rumus:
Keterangan : C = Konsentrasi standar asam amino µgml
Fp = faktor pengenceran BM = Bobot molekul dari masing-masing asam amino gmol
Kondisi HPLC pada saat berlangsungnya hidrolisis asam amino adalah sebagai berikut:
Kolom : Ultra techspere
Laju aliran fase mobil : 1 mlmenit
Detektor : Fluoresensi
Fase mobil : Bufer ANa-Asetat, Na-EDTA, Metanol, THF,
Bufer B methanol 95 dan air Panjang gelombang
: 350-450 nm
3.3.4 Analisis total mineral K, Na, Ca, Mg, Zn, Fe, Cu