21
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni yang bersifat eksploratif menggunakan rancangan percobaan desain faktorial dengan dua faktor dua level.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah
1 Propilenglikol level rendah :10 bb dan level tinggi : 12 bb.
2 Carbopol 940 level rendah :1 bb dan level tinggi : 1,5 bb.
b. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah sifat fisik gel daya sebar
dan viskositas dan stabilitas gel persen pergeseran viskositas setelah satu
bulan penyimpanan c.
Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kecepatan putar
skala 2 pada mixer, lama pencampuran, lama penyimpanan 1 bulan, kondisi penyimpanan selama 1 bulan temperatur ruangan, alat-alat
percobaan, lokasi pengambilan daun petai cina, galur tikus, umur tikus, jenis
kelamin tikus. d.
Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah suhu
ruangan, kelembaban ruangan, interaksi molekuler dalam sediaan, kecepatan perputaran batang viscotester, imunitas tikus, pola aktivitas tikus, sirkulasi
darah masing-masing tikus.
2. Definisi operasional
a.
Gel penyembuh luka ekstrak daun petai cina adalah sediaan semipadat
yang dibuat dari ekstrak daun petai cina menggunakan gelling agent Carbopol 940 dan humektan propilenglikol sesuai formula yang telah
ditentukan, dibuat sesuai prosedur pembuatan gel pada penelitian ini. b.
Gelling agent adalah bahan pembawa gel di mana merupakan faktor yang
akan dioptimasi dalam penelitian ini dan sangat berpengaruh terhadap bentuk sediaan gel, dalam hal ini adalah Carbopol 940.
c.
Humektan adalah bahan yang berfungsi sebagai pelembab dalam sediaan
gel di mana merupakan faktor yang akan dioptimasi dalam penelitian ini, dalam hal ini adalah propilenglikol.
d.
Sifat fisik dan stabilitas gel adalah parameter yang digunakan untuk
mengetahui kualitas sediaan gel. Dalam penelitian ini sifat fisik sediaan gel meliputi daya sebar dan viskositas gel, stabilitas sediaan gel meliputi persen
pergeseran viskositas gel setelah penyimpanan selama 1 bulan. e.
Desain faktorial adalah metode optimasi yang memungkinkan untuk
mengetahui efek yang dominan dalam menentukan sifat fisik dan stabilitas gel. Desain faktorial ini digunakan untuk mencari area komposisi optimum
gelling agent Carbopol 940 dan humektan propilenglikol berdasarkan
superimposed contour plot yang diprediksi sebagai formula optimum
terbatas pada jumlah gelling agent dan humektan yang diteliti.
f.
Faktor adalah besaran yang mempengaruhi respon, dalam penelitian ini
digunakan 2 faktor yaitu Carbopol 940 sebagai faktor A dan propilenglikol sebagai faktor B.
g.
Level adalah nilai atau tetapan untuk faktor, dalam penelitian ini ada 2 level
yaitu level rendah dan level tinggi. Level rendah Carbopol 940 dinyatakan dalam jumlah bahan sebanyak 1bb dan level tinggi sebanyak 1,5bb.
Level rendah propilen glikol dinyatakan dalam jumlah bahan sebanyak 10 bb dan level tinggi sebanyak 12 bb.
h.
Respon adalah besaran yang akan diamati perubahan efeknya, besarnya
dapat dikuantitatifkan. Dalam penelitian ini adalah hasil uji sifat fisik gel daya sebar dan viskositas dan stabilitas gel persen pergeseran viskositas.
i.
Efek adalah perubahan respon yang disebabkan variasi level dan faktor.
Besarnya efek dapat dicari dengan menghitung selisih antara rata-rata respon pada level tinggi dan rata-rata respon pada level rendah.
j.
Contour plot adalah grafik yang digunakan untuk memprediksi area
optimum formula berdasar satu parameter kualitas gel penyembuh luka ekstrak daun petai cina.
k.
Superimposed contour plot adalah penggabungan garis-garis pada daerah
optimum yang telah dipilih pada uji daya sebar, viskositas, dan pergeseran viskositas gel penyembuh luka ekstrak daun petai cina.
l.
Area optimum adalah area yang menghasilkan gel dengan daya sebar 3
cm tetapi 5 cm, viskositas 250-300 d.Pa.s, dan persen pergeseran viskositas setelah satu bulan penyimpanan kurang dari 10.
C. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu ekstrak daun petai cina, propilenglikol kualitas farmasetis, Carbopol 940 kualitas farmasetis,
trietanolamin, aquadest, metil paraben, 12 ekor tikus albino dewasa galur Wistar jantanbetina dengan berat 200-300 gram, Gel Bioplacenton
®
. D.
Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu glasswares Pyrex-Germany, neraca analitik, mixer, blender, waterbath, viscotester seri VT 04 RION-
JAPAN, stopwatch, seperangkat alat maserasi, Laminar Air Flow LAF, seperangkat alat maserasi, vacuum rotary evaporator, pompa vakum, autoklaf,
batang spreader, cawan petri, kertas pH indikator universal, pisau bedah steril, gunting bedah, kasa steril dan plester luka.
E. Tata Cara Penelitian
1. Pembuatan ekstrak daun petai cina
a. Pengumpulan dan pembuatan serbuk daun petai cina. Daun petai cina
diperoleh dari Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Daun dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran
yang menempel pada daun. Daun yang telah dicuci diangin-anginkan sampai daun benar-benar kering, ditandai dengan mudah dipatahkan atau hancur bila
diremas. Simplisia yang sudah kering diserbuk dengan menggunakan blender.
b. Pembuatan ekstrak cair daun petai cina
25 gram serbuk daun petai cina diekstrak dengan 500 mL campuran aquadest:etanol 96 1:1 terus menerus selama 3 hari pada suhu ruangan.
Kemudian, ekstrak disaring dengan bantuan pompa vakum dan filtratnya diekstrak lagi menggunakan 500 mL ethanol 96 selama 1 hari pada suhu
ruangan dan disaring. Kedua ekstrak tersebut dicampur dan dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator hingga konsentrasi yang diinginkan.
Ekstrak disimpan untuk keperluan selanjutnya.
2. Optimasi formula gel
a. Formula. Formula yang digunakan dalam percobaan ini mengacu pada
formula Polyherbal Gel for Wound Healing Patel A.N., 2011. Tabel II. Formula
Polyherbal Gel for Wound Healing
Ekstrak C. asiatica bb 2
Ekstrak C. longa bb 2
Ekstrak T. arjuna bb 2
Carbopol 940 934 bb 2
Propilenglikol 2mL
Etanol 5mL
Trietanolamin Secukupnya hingga basis gel netral
Aquadest Secukupnya
Dilakukan modifikasi dan optimasi terhadap formula di atas sehingga dihasilkan formula baru sebagai berikut:
Tabel III. Formula gel hasil modifikasi
Ekstrak daun petai cina bb 6
Carbopol 940 bb 1-1,5
Propilenglikol bb 10-12
Metil paraben bb 0,1
Trietanolamin TEA Secukupnya hingga basis gel
netral Aquadest
Secukupnya
Penelitian ini menggunakan 2 faktor yaitu propilenglikol dan Carbopol 940 dengan 2 level yaitu level rendah dan level tinggi. Level rendah dan level
tinggi propilenglikol dan Carbopol 940 pada formula gel penyembuh luka ekstrak daun petai cina dapat ditentukan sebagai berikut:
Tabel IV. Level rendah dan level tinggi propilenglikol dan Carbopol 940 pada formula gel penyembuh luka ekstrak daun petai cina
Formula Carbopol 940 bb
Propilenglikol bb 1
1 10
A 1,5
10 B
1 12
Ab 1,5
12
b. Pembuatan gel
Carbopol 940 dikembangkan dengan aquadest dengan cara menaburkan Carbopol 940 di atas aquadest campuran 1. Pengembangan dilakukan selama
24 jam. Propilenglikol dan metil paraben ditambahkan ke dalam campuran 1, lalu TEA ditambahkan hingga basis netral campuran 2. Melakukan
pengadukan dengan mixer selama 1 menit, kemudian disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121°C. Ekstrak daun petai cina dan sisa
aquadest yang telah disterilkan dimasukkan ke dalam campuran 2 yang telah disterilisasi, kemudian dilakukan pengadukan dengan mixer selama 1 menit.
3. Uji sifat fisik dan stabilitas fisik gel
a. Uji Organoleptis dan pH
Uji organoleptis dilakukan dengan mengamati bau dan warna gel 48 jam setelah pembuatan. Pengukuran pH dilakukan dengan bantuan indikator pH
universal pH stick dengan cara memasukkannya ke dalam sediaan dan membandingkan warna dengan standar.
b. Uji Daya Sebar
Pengukuran daya sebar sediaan gel dilakukan setelah 48 jam pembuatan. Pengukuran daya sebar dilakukan dengan cara : gel ditimbang 1 gram
kemudian gel diletakkan di tengah lempeng kaca bulat berskala. Di atas gel diletakkan kaca bulat lain dan pemberat sehingga berat kaca bulat dan
pemberat 125 gram, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicatat diameter sebarnya Garg et al., 2002.
c. Uji Viskositas
Uji viskositas dilakukan dua kali, yaitu setelah 48 jam pembuatan gel dan setelah gel disimpan selama 1 bulan. Masing-masing formula gel ditentukan
viskositasnya dengan menggunakan alat Viscotester Rion seri VT 04 Melani, Purwanti, Soeratri, 2005. Ukuran rotor yang digunakan adalah
skala 2.
4. Uji sterilitas gel ekstrak daun petai cina
Uji sterilitas dilakukan dengan spread plate technique, yaitu dengan mengambil sedikit gel, meletakkannya di medium Nutrient Agar NA yang
ditempatkan dalam cawan petri dan diratakan dengan bantuan batang spreader secara aseptis. Cawan petri diinkubasi selama ± 24 jam, lalu diamati apakah
terdapat koloni bakteri pada medium tersebut.
5. Uji aktivitas wound healing
Uji aktivitas wound healing dilakukan dengan menggunakan model luka eksisi. Tikus albino galur Wistar jantanbetina dengan berat 200-300 gram
dibagi secara acak ke dalam 6 kelompok masing-masing 1 ekor tikus. Punggung masing-masing tikus dilukai dan dipersiapkan setelah dibersihkan.
Area lingkaran dengan diameter ± 1 cm pada punggung hewan uji yang dilukai ditandai dengan spidol. Area yang ditandai dipotong kulitnya menggunakan
pisau bedah steril dan gunting setelah diberikan anastesi. Kelompok 1 diberikan gel Bioplacenton
®
kontrol positif, kelompok 2 tidak diberikan perlakuan kontrol negatif, kelompok 3, 4, 5 dan 6 diberikan gel ekstrak daun
petai cina masing-masing untuk formula 1, a, b dan ab, 1 kali sehari. Luka yang sudah diberi gel lalu dibalut dengan kasa steril dan plester luka, setiap harinya
diameter luka diukur dan diberi gel hingga luka menutup sempurna. Repetisi dilakukan tiga kali, yakni dengan memberikan 3 luka pada masing-masing
tikus. Kontraksi luka diukur sebagai persentase pengurangan luka pada area
luka untuk tiap harinya Charde et al, 2003; Sunilkumar et al, 1998. Pengurangan ukuran luka dihitung dengan rumus:
……………………………………. 2 Di mana,
∆A = perbedaan luas area luka dalam mm
2
antara awal dan pada hari particular post-operative
B = luas area luka dalam mm
2
sesaat setelah perlukaan.
F. Optimasi dan Analisis Data
Data sifat fisik dan stabilitas fisik gel yang diperoleh dianalisis sesuai dengan metode perhitungan desain faktorial untuk mengetahui efek dari Carbopol
940, propilenglikol dan interaksinya. Dengan pendekatan desain faktorial untuk menghitung koefisien b0, b1, b2, b12 sehingga didapatkan persamaan Y = b0 +
b1X1 + b2X2 + b12 X1X2. Dari persamaan ini kemudian dapat dibuat contour plot
sifat fisik gel obat luka ekstrak daun petai cina. Dari masing-masing contour plot
digabungkan menjadi contour plot superimposed untuk mengetahui area komposisi optimum Carbopol 940 dan propilenglikol, terbatas pada level yang
diteliti. Analisis data dilakukan dengan bantuan perangkat lunak R-2.14.1 dengan berbagai uji statistik yang dilakukan, antara lain: Sahpiro-Wilk untuk mengetahui
normalitas distribusi data dan Levene’s Test untuk mengetahui kesamaan varians.
Apabila data yang diuji memenuhi persyaratan uji statistik parametrik, maka dilanjutkan dengan uji ANOVA untuk melihat signifikansi antar kelompok data.
Namun, apabila tidak memenuhi persyaratan uji parametrik, maka dilanjutkan dengan uji Kruskal-Wallis dengan post hoc Wilcoxon.
31
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pembuatan Ekstrak Daun Petai Cina
1. Pengumpulan bahan dan pembuatan serbuk simplisia
Tanaman petai cina yang digunakan dalam penelitian ini dikumpulkan dari Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma,
Yogyakarta. Sebelum digunakan, tanaman perlu dipastikan kebenaran spesiesnya dengan melakukan determinasi. Determinasi tanaman dilakukan
dengan membandingkan ciri-ciri morfologi tanaman dengan kunci determinasi yang mengacu pada pustaka menurut oleh Steenis 1992. Hasil
determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan adalah Leucaena leucocephala
Lam de Wit Lampiran 6. Pengumpulan bahan dilakukan pada bulan Agustus 2012 dari pohon
yang sama dengan tujuan untuk mendapatkan keseragaman hasil. Kondisi tanaman saat pengambilan daun adalah tanaman sedang berbunga, berbuah,
usia tanaman sekitar 3 tahun, tinggi tanaman kurang lebih 4-5 meter. Dipilih daun yang masih segar, utuh dan berwarna hijau untuk menghindari adanya
kemungkinan kerusakan atau berkurangnya kandungan kimia pada daun yang dapat disebabkan oleh serangan hama atau perlakuan yang kurang tepat.
Sortasi basah dilakukan dengan mencuci daun menggunakan air mengalir, bertujuan untuk menghilangkan pengotor, seperti serangga, debu dan bahan-
bahan asing lainnya yang dapat mengganggu perolehan hasil pada penelitian. Kemudian daun dijemur di tempat yang teduh agar tidak terkena sinar
Kategori