Skrining Fitokimia Bakteri Endofit

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

4.6 Fermentasi Isolat Bakteri Endofit

Untuk mendapatkan hasil fermentasi bakteri endofit, diperlukan proses fermentasi yang bertujuan untuk memproduksi senyawa antimikroba. Fermentasi isolat dilakukan dengan cara menggojog menggunakan media Nutrient Broth, kecepatan 170 rpm, suhu 27 o C, selama 48 jam. Fermentasi dengan cara digojog merupakan metode pemanfaatan medium oleh mikroorganisme yang hasilnya lebih efisien, mempercepat pertumbuhan isolat, dan pertumbuhan yang dihasilkan lebih homogen Rante, 2013. Penggunaan 48 jam untuk fermentasi dikarenakan, pada 24 jam isolat masih berada dalam fase logaritmik maka kandungan metabolitnya masih rendah. Sedangkan pada waktu fermentasi 48 jam, isolat berada pada fase akhir logaritmik dan pada fase ini bakteri menghasilkan metabolit Khairani, 2009. Menurut Pratiwi 2008, metabolit sekunder tidak diproduksi pada saat fase logaritmik, tetapi biasanya disintesis pada akhir siklus pertumbuhan sel, yaitu pada fase stasioner. Pada fase ini sel mikroorganisme lebih tahan terhadap keadaan ekstrem, misalnya suhu yang lebih panas atau dingin, radiasi, bahan – bahan kimia, dan metabolit yang dihasilkannya sendiri misalnya antibiotik. Hasil fermentasi isolat tersebut disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm, suhu 4 o C, selama 20 menit untuk memisahkan supernatan dan biomassa. Supernatan dipisahkan dengan biomassanya, lalu supernatan yang diperoleh digunakan untuk uji aktivitas antibakteri dan skrining fitokimia. Pada penelitian digunakan suhu 4 o C pada saat fermentasi yang bertujuan untuk menahan perubahan zat yang ada didalamnya. Pemisahan supernatan dan biomassa dikarenakan mikroorganisme dapat mensekresikan metabolit sekunder selama proses fermentasi ke luar sel yang terdapat pada filtrat atau medium biakan Suswandi, 1989 dan Rante, 2013, sehingga setelah disentrifugasi segera dipisahkan antara supernatan dan biomassa.

4.7 Skrining Fitokimia Bakteri Endofit

Skrining metabolit sekunder dilakukan terhadap supernatan bakteri endofit isolat DR1, DR2, DR3 dan DR4 yang telah digojog selama 48 jam. Skrining ini dilakukan untuk mengetahui adanya kesamaan senyawa metabolit sekunder yang UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dihasilkan oleh bakteri endofit, dengan senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan oleh daun segar Agusta, 2009 dalam Fitriyah, 2013. Metabolit sekunder merupakan suatu molekul atau produk metabolit yang dihasilkan oleh proses metabolisme sekunder mikroorganisme dimana produk metabolit tersebut bukan merupakan kebutuhan pokok mikroorganisme untuk hidup dan tumbuh. Metabolit sekunder tidak diproduksi pada saat fase logaritmik, tetapi biasanya disintesis pada akhir siklus pertumbuhan sel, yaitu pada fase stasioner saat populasi sel tetap Pratiwi, 2008. Metabolit sekunder pada mikroorganisme disekresikan ke dalam media biakan Suwandi,1989, maka dari supernatan hasil fermentasi digunakan untuk skrining fitokimia. Dari hasil yang didapat, bahwa dari semua isolat memberikan hasil negatif terhadap uji terpenoidsteroid, alkaloid, saponin, flavonoid dan tanin Tabel 5. Tabel 5. Skrining Fitokimia Metabolit Sekunder Bakteri Endofit Isolat Terpenoid Steroid Alkaloid Fenolik Flavonoid Saponin DR1 - - - - - DR2 - - - - - DR3 - - - - - DR4 - - - - - Tidak terdeteksinya metabolit diduga karena dari keempat isolat yang didapat tersebut memiliki gen yang mengkode pembentukan senyawa metabolit sekunder, namun tidak terekspresi pada media produksi yang telah digunakan. Gen tersebut akan muncul apabila diberikan induksi terlebih dahulu, proses induksi dapat berupa penambahan suatu senyawa prekursor atau penambahan sejumlah tertentu inokulum isolat pada proses fermentasi Nofiani, 2009. Sedangkan dalam penelitian ini, diduga media produksi yang digunakan tidak dapat memberikan induksi untuk mengekspresikan gen pembentuk senyawa metabolit, serta penambahan sumber karbon dapat digunakan agar metabolit sekunder dapat terekspresi. Dugaan lainnya yaitu tidak adanya proses ekstraksi, pemekatan atau metabolit yang dihasilkan oleh isolat sangat sedikit pada supernatan, sehingga UIN Syarif Hidayatullah Jakarta sulit untuk menentukan metabolit sekunder apa yang diekskresikan oleh isolat sehingga sulit dideteksi dengan penggunaan reagen. Untuk menguji keberadaan metabolit pada supernatan isolat, maka dilakukan pengujian menggunakan metode KLT. Pengujian dilakukan dengan cara mentotolkan supernatan isolat DR1, DR2, DR3 dan DR4 diatas plat KLT, kemudian dielusi dengan menggunakan pelarut etanol – etil asetat 8:2. Plat KLT yang sudah dilakukan proses elusi, diamati pada sinar UV biru 254 nm dan sinar UV hijau 366 nm. Hasil yang diperoleh yaitu adanya noda berpendar pada sinar UV 254 nm dengan nilai Rf 0.85 pada isolat DR1, dan nilai Rf 0.75 pada isolat DR2, DR3 dan DR4 Gambar 12. Dengan adanya noda berpendar tersebut, diduga bahwa keempat isolat mempunyai suatu metabolit, namun belum bisa ditentukan senyawa apa yang terkandung didalamnya. Spot yang terlihat pada plat KLT memiliki polaritas yang tinggi karena eluen yang digunakan adalah pelarut etanol yang bersifat polar. a b Gambar 13. Hasil KLT Ekstrak Kasar Bakteri Endofit a Hasil monitor dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm b Hasil monitor dengan sinar UV pada panjang gelombang 366 nm. Keterangan Gambar : 1 DR1 2 DR2 3 DR3 4 DR4

4.8 Uji Aktivitas Antibakteri