34 dan padatan sehingga ekstrak mudah disterilisasi dengan membran steril
0.2 μm. Jenis oligosakarida yang terdapat dalam ubi jalar dianalisa dengan
kromatografi kertas. c. Ekstraksi dengan air mendidih AOAC 1999.
Sebanyak 5 gram tepung ubi jalar dicampur dengan 40 ml air mendidih sambil diaduk dan pH diatur pada kisaran 6.5-8 dengan
menambahkan 0.05 N KOH atau 0.05 N HCl. Elektroda dibilas dengan air mendidih. Ekstrak yang telah diatur pH-nya kemudian dipindahkan ke
dalam labu volumetrik 100 ml dan ditera mencapai 100 ml. Ekstrak dipertahankan pada suhu 85
o
C±2
o
C dengan pengadukan terus menerus selama 10 menit. Analisa oligosakarida dilakukan terhadap ekstrak dengan
kromatografi kertas.
2. Isolasi Oligosakarida Conkerton et al. 1983 dan Muzquiz et al. 1999 yang
telah dimodifikasi
Ekstrak kasar oligosakarida yang diperoleh selanjutnya dimurnikan dengan kromatografi kolom pertukaran ion resin Dowex 50WX4 H
+
, 200-400 mesh dengan modifikasi eluen yang digunakan. Untuk mengelusi
oligosakarida digunakan dua jenis eluen yaitu air dan etanol 30. Laju alir eluen adalah 1 mlmenit. Sebanyak 1 ml perfraksi oligosakarida dikumpulkan
dan diukur dengan refraktometer. Fraksi dengan kandungan padatan terlarut lebih 0
o
Brix selanjutnya diidentifikasi jenis oligosakaridanya dengan kromatografi kertas. Diagram alir isolasi oligosakarida tepung ubi jalar dapat
dilihat pada Gambar 15. Fraksi yang memiliki komposisi oligosakarida yang sama dikumpulkan dan diuji kemampuannya dalam mendukung pertumbuhan
BAL secara in vitro.
3. Pengaruh Pengolahan terhadap Kandungan Oligosakarida Tepung Olahan Ubi Jalar
a. Proses pengolahan tepung ubi jalar. Sebanyak 500 gram tepung ubi jalar diolah dengan 4 perlakuan yaitu
pemanggangan, pengukusan, penyangraian dan drum dried. Perlakuan pertama, tepung ubi jalar dicampur air dengan perbandingan 5:3.5 wv
35 dan dipanggang pada oven 160
o
C selama 30 menit. Perlakuan kedua, tepung ubi jalar dicampur air dengan perbandingan 1:1 wv dan dikukus
selama 30 menit. Perlakuan ketiga adalah tepung ubi jalar disangrai selama 5-7 menit tanpa penambahan air. Perlakuan keempat tepung ubi
jalar dicampur air hingga kekentalan menyerupai pasta dengan perbandingan tepung dan air 2:3 wv. Seluruh adonan yang diperoleh
ditepungkan dan diayak kembali agar ukuran partikel yang diperoleh seragam. Diagram alir tepung olahan ubi jalar dapat dilihat pada Gambar
16. Tepung olahan ubi jalar diekstrak dengan etanol 70. Ekstrak kasar
oligosakarida tepung olahan ubi jalar diidentifikasi oligosakaridanya dan diuji secara in vitro.
Gambar 15 Isolasi oligosakarida dari tepung ubi jalar Conkerton et al. 1983 dan Muzquiz et al. 1999 yang telah dimodifikasi.
Ekstrak kasar oligosakarida
Dielusikan pada kromatografi kolom pertukaran ion
dengan eluen air
Analisis oligosakarida dengan kromatografi kertas dan uji pertumbuhan BAL dalam media yang mengandung fraksi oligosakarida secara in vitro
Dielusikan pada kromatografi kolom pertukaran ion
dengan eluen etanol 30 Ekstraksi dengan pelarut etanol 70
Pengadukan dengan magnetic stirer selama 15 jam Penyaringan dengan kertas saring
dan pencucian dengan etanol 70
Sentrifus 2000xg selama 10 menit Filtrat dipekatkan dengan evaporator vakum pada suhu 40
o
C
Diperoleh fraksi oligosakarida
36 Diayak 60 mesh
Dicampur air dengan
perbandingan tepung : air
5:3.5 wv Dicampur air
dengan perbandingan
tepung : air 1:1 wv
Disangrai 5-7 menit
Dicampur air dengan
perbandingan tepung : air
2:3 wv
Dipanggang pada suhu
160
o
C, 30 menit Dikukus
pada suhu 100
o
C, 30 menit Dikeringkan
dengan drum dryer
Diiris-iris Diiris-iris
Dikeringkan dalam oven
55
o
C, 18 jam Dikeringkan
dalam oven 55
o
C, 18 jam
Digiling dengan willey
mill Digiling
dengan willey mill
Diayak 60 mesh Diayak 60 mesh
Digiling dengan blender
kering
Tepung panggang
ubi jalar Tepung
sangrai ubi jalar
Tepung kukus
ubi jalar Tepung
drum dried ubi jalar
Tepung ubi jalar
Gambar 16 Diagram alir tepung olahan ubi jalar.
37
b. Identifikasi oligosakarida tepung olahan ubi jalar dengan kromatografi kertas dan HPLC.
Kandungan oligosakarida tepung olahan ubi jalar yang telah diekstraksi dengan etanol 70 selanjutnya dianalisis dengan kromatografi
kertas dan HPLC. Metode dapat dilihat pada metode analisis kromatografi
kertas dan analisis HPLC. 4. Pengaruh Metode Isolasi dan Proses Pengolahan terhadap Kemampuan
Ekstrak untuk Mendukung Pertumbuhan BAL a. Pertumbuhan BAL pada fraksi oligosakarida hasil isolasi.
Fraksi oligosakarida hasil isolasi dengan eluen etanol 30 diuji kemampuannya dalam mendukung pertumbuhan BAL secara in vitro.
Fraksi dengan komponen oligosakarida yang sama dikelompokkan masing-masing pertiga fraksi yaitu fraksi A fraksi 18-20, fraksi B fraksi
21-23, fraksi C fraksi 24-26, fraksi D fraksi 27-29, fraksi E fraksi 30- 32, fraksi F fraksi 33-35 dan fraksi G fraksi 36-38. Fraksi yang telah
dikelompokkan ini dianalisa Total Padatan Terlarut TPT nya. BAL yang digunakan adalah L. casei Rhamnosus. Sebagai media pertumbuhan,
sebanyak 0.9 ml fraksi dengan TPT 5 di masukkan ke dalam 9 ml media berbasis MRS Hidaka 1986. Kemudian 0.1 ml L. casei Rhamnosus
diinokulasikan ke dalam media pertumbuhan sehingga jumlah pengujian awal L. casei Rhamnosus adalah 10
7
CFUml. Pertumbuhan L. casei Rhamnosus dihitung secara kuantitatif pada 0 jam, 24 jam dan 48 jam
dalam media MRSA dengan metode agar tuang. Sebagai pembanding fraksi oligosakarida diganti dengan glukosa dan oligofruktosa. Sebagai
kontrol digunakan etanol 30, air dan ekstrak kasar oligosakarida dari tepung segar ubi jalar.
b. Pertumbuhan BAL pada ekstrak kasar oligosakarida tepung olahan ubi Jalar.
Ekstrak kasar oligosakarida tepung olahan ubi jalar diuji efektivitasnya dalam mendukung pertumbuhan BAL. BAL yang
digunakan adalah L. casei Shirota, L. casei Rhamnosus, Lactobacills F1, Lactobacillus
G3, B. bifidum dan B. longum. Sebagai media pertumbuhan
38 adalah media berbasis MRS dengan ekstrak kasar oligosakarida tepung
olahan ubi jalar sebagai sumber gula. Sebagai pembanding digunakan ekstrak kasar oligosakarida dari tepung segar ubi jalar dan dua standar
gula yaitu glukosa dan oligofruktosa. Ekstrak kasar oligosakarida tepung olahan ubi jalar dipersiapkan
dengan TPT 5 dan standar gula dengan konsentrasi 5. Ekstrak kasar oligosakarida tepung olahan ubi jalar dan standar gula disterilkan dengan
membran filter 0.22 μm. Sebanyak 1 ml ekstrak kasar oligosakarida dan
standar masing-masing dimasukkan ke dalam dua tabung berisi 9 ml media berbasis MRS sehingga diperoleh kandungan ekstrak kasar
oligosakarida 0.5 dan konsentrasi gula standar 0.5 dalam media pengujian.
BAL diinokulasikan masing-masing 0.1 ml ke dalam dua tabung media pengujian. Lactobacillus diinkubasi secara aerob dan
Bifidobacterium diinkubasi secara anaerob pada suhu 37
o
C. Pertumbuhan BAL dihitung dengan mengukur absorbansi pada panjang gelombang
λ 600 nm pada 0 jam dan 48 jam. BAL dengan pertumbuhan terbaik pada
ekstrak ekstrak kasar oligosakarida tepung olahan ubi jalar dipilih untuk pengujian selanjutnya.
5. Kompetisi BAL dan Bakteri Patogen dalam Media yang Mengandung
Ekstrak Kasar Oligosakarida Tepung Olahan Ubi Jalar a. Persiapan kultur bakteri uji.
Penyegaran BAL dilakukan dengan menginokulasikan BAL ke dalam 10 ml MRSB dan diinkubasi selama 48 jam sebelum uji kompetisi.
Penyegaran patogen dilakukan dengan menginokulasikan patogen ke dalam 10 ml NB dan diinkubasi selama 24 jam sebelum uji. Penyegaran
hanya dilakukan ketika uji dilakukan
BAL dan patogen yang telah disegarkan dihitung jumlah awalnya dan dilakukan pengenceran sebelum dikompetisikan. BAL yang
dikompetisikan sejumlah 10
8
CFUml, sedangkan jumlah patogen yang dikompetisikan sejumlah 10
4
CFUml. Persiapan BAL adalah sebagai
39 berikut: BAL segar setelah BAL ditumbuhkan 48 jam disentrifus 3000
rpm selama 15 menit. Filtrat dibuang dengan cara dipipet sebanyak 9 ml dan di peroleh endapan BAL pellet. Endapan BAL dimasukkan larutan
pengencer 9 ml. Suspensi BAL siap digunakan. Persiapan patogen adalah sebagai berikut: patogen segar setelah patogen ditumbuhkan 24 jam
diencerkan. Untuk E. coli dan Salmonella diencerkan 1000 kali dan B. cereus
diencerkan 100 kali. b. Uji kompetisi.
Pengujian kompetisi pertumbuhan BAL dan bakteri patogen dilakukan dengan menginokulasikan secara bersama-sama BAL dan
bakteri patogen ke dalam satu medium. Sebanyak 8.1 ml media berbasis MRS steril dimasukkan 0.9 ml ekstrak kasar oligosakarida dengan TPT
5 sehingga kandungan ekstrak kasar oligosakarida dalam media menjadi 0.5 TPT. Sebanyak 1 ml BAL dan 0.1 ml patogen setelah pengenceran
diinokulasikan ke dalam media kompetisi. Untuk menghindari kontaminasi maka uji kompetisi dibagi dalam 3 tabung terpisah yang akan
diamati pada 0 jam, 24 jam dan 48 jam. BAL dan patogen dihitung
secara kuantitatif dengan metode agar tuang.
D. METODE ANALISIS 1. Kadar Air AOAC 1999
Cawan porselen dikeringkan dalam oven selama 15 menit, dinginkan dalam desikator selama 20 menit dan ditimbang. Sebanyak 5 gram sampel W
1
gram dimasukkan ke dalam cawan porselen dan dikeringkan dalam oven 100
o
C selama 1 malam 16 jam. Cawan dan sampel kemudian didinginkan dalam desikator, dan ditimbang kembali. Sampel dikeringkan kembali ke
dalam oven sampai diperoleh berat tetap W
2
gram.
