Jenis dan Rancangan Penelitian Analisis Hasil

33

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian non eksperimental dengan rancangan penelitian deskriptif komparatif, yaitu mendeskripsikan angka kapang khamir dan identifikasi Salmonella spp. Hasil pengujian angka kapang khamir dan identifikasi Salmonella spp dibandingkan dengan Peraturan Kepala Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia Nomor 12 tahun 2014 yang menyatakan bahwa angka kapang khamir yang diperbolehkan kurang dari 10 3 kolonimL dan keberadaan Salmonella spp dalam cairan obat harus negatif. Penelitian ini dilakukan di Balai Laboratorium Kesehatan Propinsi Daerah Istimewa Yogyakarta.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variable Penelitian

a. Variabel bebas Jamu beras kencur dari pasar Sambilegi Maguwoharjo Depok Sleman Yogyakarta. b. Variabel tergantung Angka Kapang Khamir dan keberadaan Salmonella spp yang terdapat dalam jamu gendong beras kencur yang di jual di pasar tradisional Maguwoharjo Depok Sleman Yogyakarta. c. Variabel pengacau terkendali Media Potato Dextrrose Agar PDA, waktu inkubasi 5 hari, media pengkayaan Salenite Broth, media isolasi Hektoen Enteric Agar, media identifikasi Salmonella media glukosa, laktosa, manitol, maltose, sukrosa, dan Sulphur Indol Motility SIM, media Simmons Sitrat Agar, media MR- VP, nutrient agar, suhu inkubasi 37 C dan waktu inkubasi 24 jam. d. Variabel pengacau tak terkendali Proses pembuatan jamu beras kencur, proses penyimpanan setelah diproduksi jamu beras kencur, waktu penyimpanan jamu beras kencur setelah diproduksi, kualitas bahan dan komposisi bahan yang digunakan dalam produksi jamu beras kencur.

2. Definisi Operasional

a. Jamu beras kencur adalah jamu dalam bentuk cairan dengan bahan utama beras dan kencur yang dikemas dengan menggunakan botol plastik yang dijual di pasar Sambilegi Maguwoharjo Depok Sleman Yogyakarta. b. Uji Angka Kapang Khamir adalah suatu uji cemaran mikroba yang dilakukan dengan menghitung jumlah koloni kapang khamir yang terdapat dalam jamu beras kencur dengan metode dan analisis hasil sesuai dengan PPOMN 2006. c. Uji identifikasi Salmonella spp adalah serangkaian uji untuk mengidentifikasi Salmonella spp yang terdapat dalam jamu beras kencur dengan melihat ada tidaknya Salmonella spp pada media selektif dengan pengujian secara biokimia. d. Sampel jamu beras kencur diambil dari tiga pedagang dan masing – masing sampel dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. Penandaan untuk masing – masing sampel dan replikasinya adalah sebagai berikut : Tabel I. Penandaan untuk masing-masing sampel Sampel Replikasi I Replikasi II Replikasi III A A1 A2 A3 B B1 B2 B3 C C1 C2 C3

C. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan

a. Bahan utama yang digunakan yaitu jamu beras kencur yang dijual di pasar Sambilegi Maguwoharjo Depok Sleman Yogyakarta. b. Media yang digunakan untuk pengujian AKK adalah Potato Dextrose Agar PDA. c. Kloramfenikol, Pepton Dilution Fluid PDF, aquadest steril, etanol 70, dan reagen kovacs. d. Media yang digunakan untuk identifkasi Salmonella adalah media pengkayaan Selinite Broth, media isolasi Hektoen Enteric Agar, media identifikasi media glukosa, media laktosa, media manitol, media maltose, media sukrosa, media MR-VP, media Sulphur Indol Motility, media Simmons Sitrat Agar, Nutrient agar. e. Bakteri baku sebagai standar pembanding adalah Salmonella typhii ATCC 14028.

2. Alat

Alat-alat yang digunakan adalah Autoklaf KT-40 ALP, Oven, Inkubator, Vortex, Mikroskop, Stomacher Seward, Pipet tetes, Pipet volume, Mikropipet, Tabung reaksi, Plastik steril, Tabung Durham, Cawan petri, Beaker glass, Gelas ukur, Neraca analitik, Erlenmeyer, Jarum ose, Hot Plate and magnetic stirrer.

D. Tata Cara Penelitian

1. Pemilihan dan pengumpulan jamu beras kencur

Berdasarkan survey yang dilakukan oleh peneliti pada bulan Maret 2015, terdapat tiga penjual jamu di Pasar Sambilegi. Sampel diambil dari tiap penjual jamu, sehingga jumlah sampel yang didapatkan sebanyak tiga sampel jamu beras kencur. Pengambilan sampel di tiap penjual jamu hanya dilakukan satu kali saja dan dilakukan tiga kali replikasi pada tiap sampel. Pengambilan sampel dilakukan pada hari senin pukul 07.00 pagi. Jamu beras kencur yang dijual oleh penjual jamu kemudian dipindahkan kedalam botol steril dan dibawa ke Balai Laboratorium Kesehatan Propinsi daerah Yogyakarta dan dilakukan pengujian yang meliputi uji Angka Kapang Khamir dan Identifikasi Salmonella spp.

2. Penyiapan sampel uji

Kemasan jamu yang akan dibuka dibersihkan dengan kapas beralkohol 70 kemudian dibuka secara aseptis di dekat nyala api bunsen.

3. Persiapan dan Homogenasi Sampel

Secara aseptis, sampel diambil sebanyak 25 ml, dimasukkan ke dalam plastik steril kemudian ditambahkan 225 ml larutan pengencer Pepton Dilution Fluid PDF sehingga diperoleh pengenceran 10 -1 . Homogenisasi menggunakan stomacher dengan kecepatan 300 rpm selama 30 detik.

4. Pengenceran sampel

Tabung reaksi disiapkan sebanyak 3 buah, masing – masing tabung reaksi diisi dengan 9 ml Pepton Dilution Fluid PDF. Sebanyak 1 ml pengenceran 10 -1 dari hasil homogenisasi pada persiapan sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung pertama yang telah berisi 9 ml PDF hingga diperoleh pengenceran 10 -2 kemudian dihomogenisasi. Selanjutnya dibuat pengenceran 10 -3 dan 10 -4 untuk pengujian AKK.

5. Uji Angka Kapang Khamir AKK

a. Pembuatan larutan kloramfenikol Sebanyak 1 gram kloramfenikol ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 100 ml aquadest steril. b. Pembuatan media Potato Dextrose Agar PDA Sebanyak 39 gram serbuk Potato Dextrose Agar dimasukkan kedalam Erlenmeyer ditambahkan 900 ml aquadest, kemudian dilarutkan dengan pemanasan menggunakan hot plate dan diaduk hingga merata dengan magnetic stirrer. Kemudian ditambahkan kloramfenikol 1g100 mL kedalam media dicampur hingga merata. Sterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 C. c. Uji AKK Satu milliliter dari masing-masing pengenceran sampel dipipet dan dituangkan ke dalam cawan petri steril secara duplo menggunakan micropipet. Media PDA sebanyak 15 ml dituangkan kedalam ke dalam cawan petri yang sebelumnya telah ditambah dengan larutan kloramfenikol, kemudian cawan petri digoyang sembari diputar sehingga suspensi merata dan biarkan membeku. Setelah membeku, cawan petri diinkubasi secara terbalik pada suhu 25 C. Pengamatan dilakukan setiap hari sampai hari ke- 5. Koloni kapangkhamir dihitung setelah 5 hari. Uji sterilitas media dilakukan dengan menuangkan media PDA dalam cawan petri steril dan dibiarkan memadat. Uji sterilitas pengencer dilakukan dengan cara menuangkan media PDA dan 1 ml pengencer Peptone Dilution Fluid lalu dibiarkan memadat.

6. Uji Identifikasi Salmonella spp pada jamu beras kencur

a. Uji pengkayaan pada media Selenite Broth Tabung sebanyak 9 buah dipersiapkan, masing – masing tabung diisi dengan 9 ml Selenite Broth. Secara asepetis, dipipet 1 ml suspensi jamu beras kencur, kemudian diisolasikan pada 9 ml Selenite Broth, diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Media Selenite Broth akan menjadi keruh jika terdapat Salmonella. Pada kontrol positif berupa kultur murni Salmonella thypi ATCC 14028 dilakukan uji yang sama dengan sampel. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari kuning jernih menjadi keruh. Hasil dari pengujian dibandingkan dengan hasil pertumbuhannya berdasarkan kekeruhan. b. Isolasi Salmonella pada media selektif Hektoen Enteric Agar HEA Pada permukaan Hektoen Enteric Agar diisolasikan 1 sengkelit dari biakan pengkayaan dengan cara streak Plate Method 4 kuadran, diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Prosedur yang sama dilakukan terhadap kontrol positif, yaitu kultur murni Salmonella thypi ATCC 14028. Hasil dari pengujian dibandingkan dengan hasil pertumbuhan kultur murni Salmonella thypi ATCC 14028. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya koloni berwarna hijau kebiruan dengan atau tanpa tiitk hitam. c. Uji konfirmasi Salmonella dalam jamu beras kencur Koloni spesifik yang terdapat pada media Hektoen Enteric Agar dipilih satu dan diinokulasikan pada Nutrient Agar NA secara goresan, kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Dari biakan NA miring dilakukan uji fermentasi gula-gula, uji sulfur, uji indol, uji motilitas, uji sitrat, uji Voges- Proskauer, uji Methyl Red, dan uji katalase. Prosedur yang sama dilakukan terhadap kontrol positif yang berupa kultur murni Salmonella typhi ATCC 14028. Hasil dari pengujian dibandingkan dengan hasil pertumbuhannya berdasarkan perubahan warna yang terjadi. 1 Uji fermentasi gula-gula a Uji fermentasi glukosa Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media glukosa dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari orange kemerahan menjadi kuning. b Uji fermentasi laktosa Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media laktosa dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari orange kemerahan menjadi kuning. c Uji fermentasi manitol Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media manitol dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari orange kemerahan menjadi kuning. d Uji fermentasi maltosa Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media maltosa dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari orange kemerahan menjadi kuning. e Uji fermentasi sakarosa Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media sukrosa dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna media dari orange kemerahan menjadi kuning. 2 Uji sulfur Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media Sulphur Indol Motility dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya warna hitam di sepanjang bekas inokulasi. 3 Uji indol Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media Sulphur Indol Motility secara tusukan dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. 1 ml pereaksi indol kovacs ditambahkan ke dalam biakan, kemudian digojog dan diamkan beberapa menit. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya cincin berwarna merah cherry pada permukaan biakan. 4 Uji motilitas Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media Sulphur Indol Motility secara tusukan pada agar tegak dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan mikroba tidak hanya pada bekas tusukan yang menunjukkan bakteri tersebut bersifat motil. 5 Uji sitrat Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media Simmon Sitrat Agar dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan perubahan warna media dari hijau menjadi biru. 6 Uji Voges-Proskauer Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media MR-VP dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam. Setelah diinkubasi tambahkan 0.6 ml larutan α-naphthol dan 0.2 ml KOH 40, kemudian digoyang-goyang sampai tercampur dan didiamkan selama 4 jam. Hasil uji positif apabila terjadi perubahan warna pink sampai merah delima. Salmonella memberikan hasil negatif untuk uji VP yaitu tidak terjadi perubahan warna pada media. 7 Uji Methyl Red Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada media MR-VP dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam. Setelah diinkubasi tambahkan 5 tetes larutan metil merah dan tabung digoyang-goyang sampai tercampur. Hasil uji positif ditandai dengan adanya difusi warna merah ke dalam media. Hasil negatif ditandai dengan terjadinya warna kuning pada media. Salmonell memberikan hasil positif untuk uji Methyl Red. 8 Uji katalase Satu sengkelit dari biakan NA miring diinokulasikan secara aseptis pada gelas objek kemudian ditetesi dengan H 2 O 2 . Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya buih.

E. Analisis Hasil

1. Analisis hasil pengujian Angka Kapang Khamir Analisis hasil pengujian kapang khamir dilakukan berdasarkan PPOMN 2006, yaitu: Cawan petri dipilih dari suatu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni 10-150 koloni. Jumlah koloni dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya. Bila pada cawan petri dari dua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan jumlah koloni 10-150, maka dihitung jumlah koloni dan dikalikan fakor pengenceran, kemudian diambil angka rata-rata. Hasil dinyatakan sebagai AKK dalam tiap ml sampel. Untuk beberapa kemungkinan lain yang berbeda dari pernyataan di atas, maka diikuti petunjuk sebagai berikut: a. Bila hanya salah satu diantara kedua cawan petri dari pengenceran yang sama menunjukkan jumlah koloni antara 10-150 koloni, dihitung jumlah koloni dari kedua cawan dan dikalikan dengan faktor pengenceran PPOMN, 2006. b. Bila pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi didapat jumlah koloni lebih besar dari dua kali jumlah koloni pada pengenceran dibawahnya, maka dipilih tingkat pengenceran terendah misal: pada pengenceran 10 -2 diperoleh 60 koloni dan pada pengenceran 10 -3 diperoleh 20 koloni, maka dipilih jumlah koloni pada pengenceran 10 -2 , yaitu 60 koloni. Bila pada pengenceran yang lebih tinggi didapat jumlah koloni dibawahnya, maka diambil rata-rata dari jumlah koloni dari kedua pengenceran tersebut. Hasil dinyatakan sebagai angka kapang khamir dalam tiap ml sampel misal: pada pengenceran 10 -2 diperoleh 60 koloni dan pada pengenceran 10 -3 diperoleh 10 koloni, maka angka kapang kamir adalah: + � 3 = 8 x 10 3 PPOMN, 2006. c. Bila dari seluruh cawan petri tidak ada satupun yang menunjukkan jumlah antara 10-150 koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari tingkat pengenceran terendah dan dihitung sebagai angka kapang khamir perkiraan PPOMN, 2006. d. Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan dan bukan disebabkan karena faktor inhibitor, maka angka kapang khamir dilaporkan sebagai kurang dari satu dikalikan faktor pengenceran terendah 1 x faktor pengenceran terendah PPOMN, 2006. e. Bila pada pengenceran 10 -1 sampai 10 -3 terdapat pertumbuhan koloni kapang khamir yang sangat banyak sehingga tidak dapat dihitung maka jumlah koloni yang dihitung yaitu pada pengenceran 10 -4 sebagai nilai angka kapang khamir BalKes, 2000. 2. Analisis hasil identifikasi bakteri Salmonella spp. Tabel II. Hasil uji identifikasi Salmonella spp. UJI Salmonella spp. Holt dkk, 2000; Soemarno, 2000 Glukosa + Laktosa _ Manitol + Maltosa + Sakarosa _ Sulfur + Indol + Motilitas + Sitrat + Methyl Red + Voges-Proskauer _ Katalase + 46

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Tanaman obat merupakan sumber daya alam hayati yang memiliki nilai ekonomi tinggi. Pemanfaatan obat tradisional pada umumnya lebih diutamakan untuk mencegah penyakit dan menjaga kesehatan, serta upaya pengobatan suatu penyakit. Salah satu kelompok obat tradisional adalah jamu. Jamu sudah dikenal di Indonesia, khususnya di Pulau Jawa sebagai sarana perawatan kesehatan sehari – hari maupun sarana pemulihan kesehatan dari sakit. Pembuatan jamu gendong dan jamu racikan dapat dilakukan tanpa pengujian dan proses pendaftaran bahan jamu. Oleh karena itu, kualitas jamu yang dihasilkan belum dapat dipastikan karena tidak diketahui ada atau tidaknya cemaran mikroba. Sebagaimana diatur dalam Peraturan Kepala Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia Nomor 12 tahun 2014 bahwa, persyaratan obat tradisional terutama cairan obat dalam, yaitu keseragaman volume, penentuan kadar alkohol, penentuan BJ dan pH, cemaran mikroba Angka Lempeng Total, Angka Kapang Khamir, Eschericia coli, Salmonella spp, Shigella spp, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, aflatoksin, cemaran logam berat, bahan tambahan pengawet, pewarna dan pemanis, wadah dan penyimpanan. Angka kapang khamir yang diperbolehkan adalah 10 3 kolonimL. Mikroba patogen harus mempunyai nilai negatifmL. Uji yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi uji AKK dan identifikasi bakteri Salmonella spp.