Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Nikotin dan Asetanilida Optimasi Metode KCKT Fase Terbalik

5. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Nikotin dan Asetanilida

a. Penentuan panjang gelombang pengamatan nikotin. Dilakukan screening larutan baku nikotin 20, 30 dan 40 µgmL pada daerah panjang gelombang 225 –300 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Panjang gelombang pengamatan ditentukan berdasarkan spektra serapan maksimum yang dihasilkan. b. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan asetanilida. Dilakukan screening larutan baku asetanilida 1, 5 dan 10 µgmL pada panjang gelombang 225 –300 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Panjang gelombang pengamatan ditentukan berdasarkan spektra serapan maksimum yang dihasilkan.

6. Optimasi Metode KCKT Fase Terbalik

a. Optimasi pemisahan nikotin dalam sampel fraksi kloroform ekstrak etanolik tembakau rokok. Diambil 100 µL larutan baku nikotin 200 µgmL, tambahkan 100 µL larutan internal standar asetanilida 100 µgmL dan tambahkan 800 µL metanol 30. Saring dengan milipore dan diawaudrakan selama 2 menit, diinjeksikan dalam sistem KCKT fase terbalik dengan pengaturan detektor pada panjang gelombang 260 nm. Dilakukan pengubahan kecepatan alir 0,5; 0,8 dan 1,0 mLmin dan komposisi fase gerak metanol : ammonium asetat 10 mM + TEA 0,1 50:50; 60:40; 70:30 pada sistem KCKT fase terbalik. Data kromatogram baku yang diperoleh diamati sehingga diperoleh kondisi sistem KCKT fase terbalik yang dapat memberikan pemisahan nikotin yang baik. b. Reprodusibilitas retention time baku. Masing-masing seri larutan baku nikotin 20, 60 dan 100 µgmL dan asetanilida dengan konsentrasi 10 µgmL diinjeksikan dalam sistem KCKT dengan komposisi fase gerak dan kecepatan alir optimal, dilakukan replikasi tiga kali. Retention time dari kromatogram yang didapatkan kemudian dihitung nilai CV-nya sebagai paramater reprodusibilitas. c. Reprodusibilitas resolusi sampel. Sampel hasil ekstraksi diinjeksikan ke dalam sistem KCKT dengan komposisi fase gerak dan kecepatan alir optimal, dilakukan repetisi tiga kali. Resolusi kromatogram yang didapat kemudian dihitung nilai CV-nya sebagai parameter reprodusibilitas. Penentuan reprodusibilitas sampel juga dilakukan pada sampel yang ditambahkan baku nikotin 20 µgmL, dilakukan repetisi tiga kali.

G. Analisis Hasil