Jenis Rancangan Penelitian Bahan Penelitian Alat Penelitian Analisis Hasil

35

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis Rancangan Penelitian

Jenis rancangan penelitian ini adalah rancangan eksperimental murni untuk mencari formula multiemulsi AMA ekstrak rosella yang optimal sifat dan stabilitas fisisnya untuk kemudian dilakukan uji aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi AMA dan dalam suspensi liposom dengan menggunakan metode DPPH.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel penelitian

a. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi eksipien dan HLB multiemulsi AMA, lama penyimpanan, dan jenis formulasi b. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah sifat dan stabilitas fisis multiemulsi AMA, serta aktivitas antioksidan IC 50 ekstrak rosella dalam multiemulsi AMA dan dalam suspensi liposom. c. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah cahaya selama pembuatan dan penyimpanan multiemulsi AMA, udara dan suhu saat pembuatan dan penyimpanan multiemulsi AMA dan suspensi liposom, dan homogenitas sediaan. d. Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah kelembaban ruangan saat pembuatan multiemulsi AMA, ukuran partikel, serta matriks sediaan multiemulsi AMA dan suspensi liposom.

2. Definisi operasional

a. Ekstrak rosella adalah sediaan cair dan kental hasil ekstraksi simplisia bunga rosella menggunakan pelarut metanol. b. Antioksidan adalah zat yang dalam konsentrasi rendah dibandingkan zat yang mudah teroksidasi, secara signifikan dapat menunda atau mencegah oksidasi zat yang terdapat pada jaringan termasuk protein, lipid, karbohidrat, dan DNA. Zat yang berperan sebagai antioksidan dalam penelitian ini adalah ekstrak rosella. c. Multiemulsi AMA ekstrak rosella adalah sistem emulsi AM yang mengandung ekstrak rosella dan didispersikan dalam fase air dengan menggunakan bantuan emulsifier. d. Formula optimum multiemulsi AMA ekstrak rosella adalah formula yang telah stabil sifat dan stabilitas fisisnya setelah penyimpanan selama 28 hari. e. Sifat fisis multiemulsi AMA meliputi uji organoleptis sediaan, uji pH, uji tipe fase emulsi, dan pengamatan mikroskopik multiemulsi AMA yang dilakukan setelah proses pembuatan. f. Stabilitas fisis multiemulsi AMA meliputi uji volume pemisahan multiemulsi AMA yang dilakukan selama 28 hari penyimpanan pada suhu -4 o C, terlindung dari cahaya, dan disertai penjenuhan dengan gas nitroge, serta pengamatan mikroskopik pada hari ke 1 dan ke-28. g. Liposom ekstrak rosella adalah suatu sistem yang terdiri dari satu atau lebih lipid bilayer dengan struktur vesikular dan mengelilingi sejumlah ekstrak rosella dalam medium air. h. Suspensi liposom adalah sediaan cair yang mengandung liposom ekstrak rosella yang dibuat menggunakan metode pertukaran pelarut organik, yang kemudian didispersikan dalam medium dispersi yang sesuai dengan bantuan suspending agent. i. Metode DPPH adalah metode uji aktivitas antioksidan yang didasarkan pada kemampuan antioksidan untuk menghambat radikal bebas dengan mendonorkan atom hidrogen yang ditunjukkan dengan perubahan warna ungu dari DPPH menjadi kuning. Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan selama 28 hari untuk mengetahui laju penurunan aktivitas antioksidan ekstrak rosella. j. Inhibition Concentration 50 IC 50 adalah konsentrasi ekstrak rosella yang dibutuhkan untuk menghambat atau meredam radikal DPPH sebesar 50 .

C. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak rosella yang diperoleh dari Sanjayadi, aquadest Laboratorium Kimia Organik, parafin cair kualitas farmasetik, PT. Brataco Yogyakarta, Span 80® kualitas farmasetik, PT. Brataco Yogyakarta, dimethicone kualitas farmasetik, PT. Brataco Yogyakarta, Tween 80® kualitas pro analysis, Merck, setil alkohol, magnesium sulfat, xanthan gum, metanol kualitas pro analysis, Merck, 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl kualitas pro analysis, Sigma Aldrich, BHT kualitas pro analysis, Sigma Aldrich, Triton X-100® kualitas pro analysis, Sigma Aldrich, dan gas nitrogen teknis yang diperoleh dari CV. Perkasa Yogakarta.

D. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, flakon, parafilm , mixer Miyako, waterbath Elbanton, alat ultrasonifikasi Retsch, alat sentrifugasi PLC –03, vortex Scientific Industries, seperangkat spektrofotometer UV-Vis Shimadzu UV-1800, kuvet disposable 2,5 mL, mikropipet Socorex, mikroskop Olympus CX31, timbangan analitik Mettler Tolledo , stopwatch, dan alumunium foil.

E. Tata Cara Penelitian

1. Ekstraksi kelopak bunga rosella

Sebanyak 5 kg kelopak bunga rosella segar yang didapatkan dari Pontianak, Kalimantan Barat dicuci dengan air mengalir sebanyak tiga kali dan kemudian dicuci kembali menggunakan aquadest. Kelopak bunga rosella dimaserasi dengan 5 mL metanol menggunakan ultraturrax pada suhu ruangan selama dua hari. Supernatan disaring menggunakan corong Buchner dengan kertas saring Whatman nomor satu. Filtrat yang didapatkan kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 40 o C. Ekstrak disimpan pada suhu -4 o C dalam wadah polietilen yang dibungkus dengan alumium foil serta dijenuhkan dengan gas nitrogen hingga waktu analisis. Ekstraksi ekstrak rosella dilakukan oleh Sanjayadi.

2. Penetapan bobot tetap ekstrak

Sebanyak 500 μL ekstrak kental metanolik rosella dipanaskan menggunakan waterbath pada suhu 40°C - 50°C di atas cawan porselen hingga memperoleh bobot tetap. Bobot tetap adalah berat pada penimbangan 2 kali berturut-turut setelah zat dikeringkan selama 1 jam hingga tidak berbeda lebih dari 0,5 mg tiap gram sisa yang ditimbang. Penetapan bobot tetap ekstrak dilakukan sebanyak 3 kali replikasi Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1975.

3. Formulasi dan optimasi multiemulsi AMA

Fase air yang mengandung zat aktif ekstrak rosella, emulsifier Tween 80, dan elektrolit MgSO 4 serta fase minyak parafin cair yang mengandung emulsifier Span 80, setil alkohol, dan dimethicone dipanaskan pada suhu 50±3 o C di atas waterbath. Fase air diemulsifikasikan ke dalam fase miyak menggunakan mixer dengan skala kecepatan 5 selama 10 menit untuk mendapatkan droplet emulsi primer AM. Emulsi AM kemudian diemulsifikasikan dalam larutan air eksternal yang mengandung emulsifier Tween 80 dan xanthan gum menggunakan mixer dengan skala kecepatan 1 selama 10 menit. Keseluruhan proses pencampuran disertai dengan penjenuhan menggunakan gas nitrogen. Multiemulsi dimasukkan dalam flakon yang dibungkus dengan alumunium foil agar terlindung dari cahaya dijenuhkan dengan gas nitrogen sebelum ditutup rapat dengan parafilm, dan disimpan dalam lemari es dengan suhu -4 o C selama pengujian 28 hari. Optimasi formula dan proses pembuatan multiemulsi AMA yang dilakukan meliputi: a. Optimasi emulsifier emulsi primer berdasarkan nilai HLB Emulsi primer dibuat dengan kombinasi emulsifier primer yaitu Span 80 dan Tween 80 dengan konsentrasi sebesar 10 untuk mendapatkan HLB sebesar 5; 5,3; 5,5; dan 5,8. Berdasarkan hasil optimasi tersebut dipilih formula emulsi primer dengan persen pemisahan fase terendah. b. Optimasi kecepatan pencampuran emulsi primer Emulsi primer dibuat dengan formula terbaik yang didapatkan pada optimasi emulsifier primer menggunakan mixer pada skala kecepatan 4 dan 5. Berdasarkan hasil optimasi tersebut tersebut dipilih formula emulsi primer dengan persen pemisahan fase terendah. c. Optimasi lama pencampuran emulsi primer Emulsi primer skala kecepatan yang telah teroptimasi dengan lama pencampuran 10; 15; dan 20 menit. Berdasarkan hasil optimasi tersebut dipilih formula emulsi primer dengan persen pemisahan fase terendah. d. Optimasi eksipien setil alkohol sebagai stiffening agent Emulsi primer dibuat dengan formula terbaik yang didapatkan pada optimasi lama pencampuran emulsi primer dan ditambahkan setil alkohol sebesar 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 8; dan 10. Berdasarkan hasil optimasi tersebut dipilih formula emulsi primer dengan persen pemisahan fase terendah. e. Optimasi eksipien dimethicone sebagai antifoaming agent Emulsi primer dibuat dengan formula terbaik yang didapatkan pada optimasi eksipien setil alkohol dan ditambahkan dengan dimethicone sebesar 2; 4; 6; dan 8. Berdasarkan hasil optimasi tersebut dipilih formula emulsi primer dengan persen pemisahan fase terendah. f. Optimasi rasio fase emulsi primer dan fase air eksternal Multiemulsi AMA dibuat dengan memasukkan emulsi primer hasil optimasi ke dalam fase air dengan perbandingan 3:6; 4:6; dan 5:6. Berdasarkan hasil optimasi tersebut dipilih formula multiemulsi dengan persen pemisahan fase terendah. g. Optimasi emulsifier sekunder Multiemulsi AMA dibuat dengan ratio emulsi primer dan air eksternal hasil optimasi dengan jumlah emulsifier tunggal Tween 80 dengan konsentrasi 2; 4; dan 6. Berdasarkan hasil optimasi tersebut dipilih formula multiemulsi dengan persen pemisahan fase terendah. h. Optimasi lama pencampuran multiemulsi AMA Multiemulsi AMA dibuat dengan formula terbaik yang didapatkan pada optimasi jumlah emulsifier sekunder pada skala kecepatan 1 dengan lama pencampuran 10; 12; dan 15 menit. Berdasarkan hasil optimasi tersebut dipilih formula multiemulsi dengan persen pemisahan fase terendah.

4. Evaluasi multiemulsi AMA

Evaluasi terhadap formula optimum multiemulsi AMA ekstrak rosella antara lain: a. Pengamatan organoleptis dan pH Multiemulsi AMA diamati aspek penampilan, rasa, dan bau pada hari pertama dan hari ke-28 sebelum dilakukan pengujian aktivitas antioksidan. Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan indikator pH universal dengan cara memasukkan pH strips ke dalam multiemulsi AMA dan dibandingkan warnanya dengan standar Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1975. b. Ukuran diameter partikel rata-rata Diameter partikel rata-rata multiemulsi AMA diukur dengan menggunakan mikroskop cahaya yang dilengkapi dengan lensa okuler, mikrometer yang telah dikalibrasi dan seperangkat kamera pada hari pertama dan hari ke-28 sebelum dilakukan pengujian aktivitas antioksidan. Multiemulsi AMA diletakan pada kaca objek dan ditutup dengan gelas penutup. Kemudian diamati dengan menggunakan mikroskop pada perbesaran 40 kali. Multiemulsi AMA yang diamati, difoto, dan diukur diameter partikelnya menggunakan aplikasi ImageJ Martin, Swarbrick, dan Cammarata, 1993. c. Uji tipe fase emulsi Uji tipe fase emulsi dilakukan setelah dilakukan pembuatan emulsi primer dan multiemulsi AMA dengan formula optimum. Emulsi primer dan multiemulsi AMA dilarutkan dalam aquadest dan parafin cair, kemudian diamati kelarutan masing-masing emulsi dalam kedua fase tersebut Billany, 2001. d. Uji mekanik Uji mekanik dilakukan setelah dilakukan pembuatan multiemulsi AMA dengan formula optimum. Multiemulsi AMA dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi dan dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 20 menit. Hasil sentrifugasi diamati dengan melihat ada atau tidaknya pemisahan fase Mahmood, Akhtar, dan Manickam, 2014. e. Uji volume pemisahan Uji volume pemisahan dilakukan setelah dilakukan pembuatan multiemulsi AMA dengan formula optimum. Multiemulsi AMA dimasukkan dalam tabung reaksi berskala dan diamati secara berkala selama rentang waktu pengujian apabila terjadi perubahan tinggi akibat pemisahan creaming atau pengendapan. Tabung reaksi berskala ditempatkan pada suhu dingin yaitu -4 o C, terlindung dari cahaya, dan disertai penjenuhan dengan gas nitrogen Billany, 2001.

5. Penentuan aktivitas antioksidan multiemulsi AMA ekstrak rosella

a. Pembuatan pereaksi DPPH Sebanyak 50 mg serbuk DPPH BM = 394,32 gmol dimasukkan dalam labu takar 100 mL dan dilarutkan dalam metanol p.a hingga batas tanda sehingga diperoleh konsentrasi pereaksi DPPH 1,27 mM. b. Penentuan panjang gelombang maksimum Sebanyak 180 μL larutan DPPH 1,27 mM dimasukkan dalam kuvet dan ditambahkan metanol hingga 3 mL. Kemudian dilakukan scanning panjang gelombang dengan kisaran 450-550 nm. Panjang gelombang maksimum adalah absorbansi paling tinggi peak dari larutan DPPH pada rentang panjang gelombang tersebut. Metanol digunakan sebagai blanko. c. Preparasi sampel ekstrak rosella total dalam multiemulsi AMA Aktivitas antioksidan total dalam multiemulsi AMA diukur dengan melakukan uji secara metode DPPH terhadap ekstrak rosella yang terjerap maupun tidak terjerap dalam droplet emulsi. Sebanyak 8,5 gram multiemulsi AMA diultrasonifikasi selama 30 menit, kemudian disentrifugasi selama 40 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Sebanyak 2,5 mL supernatan dari hasil sentrifugasi 5000 rpm ditambahkan metanol sebanyak 5 mL dan disentrifugasi selama 20 menit. Sebanyak 4 mL supernatan dari hasil sentrifugasi dimasukkan dalam labu takar 10 mL, ditambahkan dengan metanol hingga batas tanda dan dianalisis kandungan antioksidannya dengan metode DPPH. d. Penentuan aktivitas antioksidan dengan metode DPPH Aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi AMA ditentukan dengan metode DPPH. Pengukuran terhadap larutan DPPH dengan konsentrasi tertentu dilakukan untuk mendapatkan absorbansi larutan DPPH dengan nilai lebih dari 0,8, yang selanjutnya konsentrasi larutan DPPH tersebut digunakan sebagai konsentrasi yang ditambahkan dalam seri konsentrasi sampel ekstrak. Seri konsentrasi sampel ekstrak dimasukkan dalam kuvet dan ditambahkan larutan DPPH. Selanjutnya ditambah metanol p.a hingga 3 mL dan didiamkan selama 15 menit Sanjayadi, 2014. Metanol p.a digunakan sebagai blanko. Penentuan aktivitas antioksidan dari BHT dilakukan pula sebagai kontrol positif dengan metode dan prosedur yang sama. Setiap sampel dianalisis dengan replikasi sebanyak 3 kali.

6. Evaluasi suspensi liposom

Suspensi liposom yang diperoleh dari Sanjayadi disimpan dalam lemari pendingin dengan suhu 4 o C menurut penelitian oleh Pinsuwan dkk. 2010 selama pengujian 14 hari. Wadah penyimpanan suspensi liposom dibungkus dengan alumunium foil agar terlindung dari cahaya. a. Pengamatan organoleptis dan pH Suspensi liposom diamati aspek penampilan, rasa, dan aroma pada hari pertama dan hari ke-14 sebelum dilakukan pengujian aktivitas antioksidan. Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan indikator pH universal dengan cara memasukkan pH strips ke dalam suspensi liposom dan dibandingkan warnanya dengan standar Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1975. b. Ukuran diameter partikel rata-rata Diameter partikel rata-rata suspensi liposom diukur dengan prosedur yang sama yang telah disebutkan pada poin 3.b. Pengukuran diameter partikel rata-rata suspensi liposom dilakukan pada hari pertama sebelum dilakukan pengujian aktivitas antioksidan.

7. Penentuan aktivitas antioksidan suspensi liposom ekstrak rosella

a. Pembuatan pereaksi DPPH Pembuatan pereaksi DPPH dilakukan dengan prosedur yang sama yang telah disebutkan pada poin 5.a. b. Penentuan panjang gelombang maksimum Pembuatan pereaksi DPPH dilakukan dengan prosedur yang sama yang telah disebutkan pada poin 5.b. c. Preparasi sampel ekstrak rosella total dalam suspensi liposom Aktivitas antioksidan total dalam suspensi liposom diukur dengan melakukan uji secara metode DPPH terhadap ekstrak rosella yang terjerap maupun tidak terjerap dalam fosfolipid liposom. Sebanyak 1 mL liposom ditambahkan dengan Triton X-100 10 1:1 dan divortex. Larutan dimasukkan dalam labu takar 10 mL, ditambahkan dengan metanol hingga batas tanda dan dianalisis kandungan antioksidannya dengan metode DPPH. d. Penentuan aktivitas antioksidan dengan metode DPPH Penentuan aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam liposom dilakukan dengan prosedur yang sama yang telah disebutkan pada poin 5.d.

F. Analisis Hasil

Persen pemisahan fase sebagai parameter pemilihan formula optimum dari masing-masing tahap optimasi dihitung berdasarkan persamaan berikut: pemisahan fase = [ ] ------------2 Keterangan: Volume awal = volume multiemulsi AMA yang dimasukkan dalam tabung berskala yaitu 25 mL Volume pemisahan = volume fase air yang terpisah dari multiemulsi setelah penyimpanan 24 jam Aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi AMA dan suspensi liposom dihitung nilai inhibisi berdasarkan persamaan berikut: inhibisi = [ ] ---------------------3 Keterangan: A kontrol = absorbansi kontrol DPPH A sampel = absorbansi larutan uji Aktivitas antioksidan ditunjukkan dengan nilai IC 50 yaitu konsentrasi efektif sampel yang dibutuhkan untuk memberikan penghambatan DPPH sebesar 50 dengan analisis regresi linear dari plot kurva respon dosis antara inhibisi dan konsentrasi, kemudian memplotkan nilai 50 pada sumbu y masing-masing kurva regresi linear. Aktivitas antioksidan multiemulsi AMA dibandingkan pada beberapa rentang waktu selama 1 bulan yaitu hari ke-1, 3, 7, 14, dan 28. Aktivitas antioksidan multiemulsi AMA dibandingkan dengan aktivitas antioksidan suspensi liposom pada rentang waktu hari ke-1 dan 14. Aktivitas antioksidan dari masing-masing jenis sediaan dibandingkan pula dengan aktivitas antioksidan kontrol positif BHT dan dinyatakan dalam mikromol ekuivalen Trolox TE per 100 gram sampel TE100gram. Menurut penelitian oleh Prakash 2011, BHT memiliki aktivitas antioksidan sebesar 395000 TE100gram. Pengujian kesamaan variansi secara statistik dengan uji F untuk menguji kesamaan homogenitas variasi dua populasi sehingga dapat ditentukan metode untuk pengujian signifikansi dengan uji t. Uji signifikansi secara statistik dengan uji t dilakukan terhadap nilai IC 50 ekstrak rosella dalam multiemulsi AMA dan suspensi liposom pada hari pertama, serta terhadap laju penurunan aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi AMA dan suspensi liposom dari hari pertama hingga hari ke-14. Nilai t yang diperoleh dibandingkan dengan nilai t yang telah ditetapkan pada taraf kepercayaan 95 Miller dan Miller, 2010. 49

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Multiemulsi AMA yang dibuat dalam penelitian ini memiliki efek antioksidan karena mengandung ekstrak rosella sebagai zat aktif. Sediaan multiemulsi AMA formula optimum diamati sifat dan stabilitas fisisnya, serta dilakukan pengujian terhadap aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi AMA dan suspensi liposom. Multiemulsi merupakan sistem emulsi air dalam minyak dalam air atau minyak dalam air dalam minyak, yang fase terdispersinya mengandung droplet yang lebih kecil dengan fase yang berbeda Jiao dan Burgess, 2008. Bentuk sediaan multiemulsi dipilih karena memiliki kapasitas yang baik untuk menjebak zat aktif yang bersifat hidrofilik dalam droplet-droplet air internal, memberikan efek protektif terhadap zat aktif yang mudah terdegradasi, dan dapat memberikan efek pelepasan yang terkendali dari zat aktif Jigar, Adarsh, Dhaval dan Vijay, 2011. Penelitian oleh Pinsuwan dkk. 2010 menunjukkan bahwa liposom yang mengandung ekstrak rosella memiliki entrapment efficiency yang tinggi, meningkatkan permeasi pada kulit, dan mengurangi iritasi pada kulit. Struktur liposom yang berupa vesikel lipid lapis ganda dapat melindungi zat aktif dari pengaruh lingkungan sehingga meningkatkan stabilitas zat aktif dalam sediaan. Multiemulsi dan liposom memiliki kelebihan masing-masing dalam perannya sebagai pembawa yang melindungi zat aktif. Maka dari itu, dalam penelitian ini dilakukan formulasi multiemulsi AMA yang mengandung ekstrak