7 Uji Terpenoid Sebanyak 2,5 mL larutan uji dicampur dengan 1 mL kloroform dan
ditambah 1,5 mL H
2
SO
4
pekat secara hati-hati lewat dinding. Hasil positif ditunjukkan dengan larutan menjadi warna coklat kemerahan pada
permukaan dalam larutan Edeoga, Okwu, dan Mbaebre, 2005.
7. Uji identifikasi bakteri
a. Staphylococcus aureus
Bakteri ditanam di media geolitik, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
C. Bakteri diisolasi dari media geolitik ke media Enrich, diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 37
C. Jika terdapat endapan hitam dengan kabut putih diduga bakteri Staphylococcus aureus. Kemudian, diambil 1-2 ose bakteri,
diinokulasi ke dalam media gula glukosa, laktosa, manitol, maltosa, sakarosa, media NA miring, media Simons Citrate SC, media Sulfure Indole Motil
SIM dan diinkubasi selama 24 jam. Pengecatan Gram dilakukan setelah inkubasi selama 24 jam pada suhu 37
C. b.
Escherichia coli Bakteri ditanam ke media penyubur Brilliant Green Lactose Blue
BGLD kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 44 C. Jika terdapat
gelembung udara dari tabung Durham yang terdapat di dalam tabung reaksi diduga bakteri Escherichia coli. Setelah itu, bakteri diisolasi lalu ditanam ke
media TBX Tryptone Bile X-Glucoronide dan diinkubasi pada suhu 37 C
selama 24 jam. Pada media isolasi setelah 24 jam diketahui tersangka Escherichia coli
dengan timbulnya warna hijau. Kemudian, bakteri diambil 1-2 ose, diinokulasi ke dalam media gula laktosa, glukosa, sakarosa, manitol,
maltosa, NA, SC Simon Citrate, SIM Sulfur Indol Motil dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah 24 jam diinkubasi, dilakukan pengecatan Gram.
8. Uji potensi ekstrak etanol kulit batang pohon petai terhadap S. aureus dan E.
coli.
a. Pembuatan variasi konsentrasi larutan uji Sebanyak 2,5 gram ekstrak kental kulit batang pohon petai ditimbang
kemudian dilarutkan dengan 5 mL DMSO 5 sehingga diperoleh konsentrasi 50. Konsentrasi 50 diencerkan sehingga diperoleh konsentrasi 25; 12,5;
6,25; 3,125. Kontrol negatif yang digunakan dalam penelitian ini adalah DMSO 5 dan kontrol positif yang digunakan adalah amoksisilin 125 mg 5 mL
untuk S. aureus dan E. coli. b. Pembuatan suspensi bakteri uji
Sebanyak 1-3 ose diambil dari stok bakteri S. aureus dan E. coli, kemudian diinokulasikan ke dalam tabung reaksi yang berisi MHB Mueller Hinton Broth
dan divortex agar tercampur rata, lalu dilihat kekeruhannya. Kekeruhan suspensi bakteri disetarakan dengan larutan Mac Farland 0,5 1,5 x 10
8
CFUmL.
c. Uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi sumuran Sebanyak 15 mL MHA steril dituang ke dalam cawan petri steril dan
dibiarkan memadat. Media MHA yang telah memadat pada cawan petri kemudian dapat di streak menggunakan cotton bud steril yang sebelumnya
dicelup dahulu ke dalam suspensi bakteri uji secara merata. Metode ini menggunakan metode Kirby Bauer Mpila, dkk, 2012. Sumuran dibuat dengan
menggunakan pelubang sumuran no. 6 sebanyak 7 lubang sumuran pada media yang telah padat dan ditumbuhi bakteri uji. Ekstrak etanol kulit batang pohon
petai dengan variasi konsentrasi 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125, kontrol negatif DMSO 5, dan kontrol positif Amoksisilin 125 mg5 mL
dimasukkan pada lubang sumuran sebanyak 50 µL. Media uji yang telah berisi ekstrak, control positif dan kontrol negatif diinkubasi selama 24 jam pada suhu
37 C lalu diamati dan diukur diameter zona hambat yang dihasilkan. Zona
hambat yang terbentuk diukur dengan penggaris. Dalam uji aktivitas antibakteri ini dilakukan replikasi sebanyak 3 kali replikasi.
d. Penentuan KHM dan KBM dengan metode dilusi cair Pada uji aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi sumuran,
didapatkan konsentrasi terkecil dari ekstrak kulit batang pohon petai yang mempunyai aktivitas antibakteri. Dari konsentrasi terkecil tersebut, dibuat variasi
konsentrasi yang rentangnya lebih sempit sebanyak 10 konsentrasi 0,785; 1,563; 3,125; 6,25; 12,5; 15,625; 18,750; 21,875; 25; 50
untuk mengetahui KHM dan KBM dari masing-masing ekstrak. Pengujian
dilakukan dengan membuat suspensi bakteri yang kekeruhannya disetarakan dengan larutan Mac Farland 0,5 1,5 x 10
8
CFU. Dari suspensi tersebut, diambil 200 µL, ditambah dengan larutan uji yang berisi ekstrak etanol kulit batang
pohon petai dengan konsentrasi tertentu dan dicampur rata dengan 5 mL MHB. Setelah itu diukur nilai absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis
480 nm sebelum inkubasi dan setelah inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C.
Hasil selisih dari absorbansi tersebut digunakan sebagai nilai Optical Density OD. Kemudian konsentrasi ekstrak etanol kulit batang pohon petai yang
mempunyai nilai ∆ OD = 0 akan ditegaskan ke dalam media MHA padat,
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C, lalu diamati pertumbuhan bakteri.
Apabila pada media MHA tumbuh koloni bakteri maka konsentrasi ekstrak etanol kulit batang pohon petai tersebut menghambat pertumbuhan bakteri
KHM dan jika media MHA tersebut tidak terdapat pertumbuhan bakteri maka konsentrasi ekstrak etanol kulit batang pohon petai membunuh pertumbuhan
bakteri KBM. Penentuan KHM dan KBM dengan metode dilusi cair dilakukan 3 kali replikasi.
E. Analisis Hasil
