H. Pengukuran Kadar Hambat Minimum KHM dan Kadar Bunuh Minimum
KBM Ekstrak Etanol Kulit Batang Pohon Petai Terhadap S. aureus dengan
Metode Dilusi Cair
Seri konsentrasi dalam pengukuran KHM dan KBM diperoleh dari konsentrasi terkecil ekstrak etanol kulit batang pohon petai yang mampu
menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus dengan metode difusi sumuran yang mempunyai zona hambat yang lebih besar dari kontrol negatif DMSO yaitu
3,125. Prinsip metode dilusi yaitu pengenceran senyawa uji antibakteri sehingga diperoleh beberapa konsentrasi. Seri konsentrasi yang digunakan 0,782; 1,563;
3,125; 6,25; 12,5; 15,625; 18,750; 21,875; 25 dan 50. Uji dilusi cair ini hanya dilakukan terhadap bakteri S. aureus karena bakteri E.coli tidak
memiliki zona hambat pada uji difusi sumuran. Senyawa uji memiliki daya antibakteri apabila nilai kekeruhan yang dimiliki media uji sama atau lebih kecil
dibandingkan dengan kontrol pertumbuhan. Uji dilusi cair dilakukan tiga kali replikasi.
Penentuan KHM dan KBM dilakukan secara kuantitatif dengan mengukur Optical Density OD menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Prinsip
spektrofotometri UV-Vis berdasarkan hukum Lambert-Beer, yaitu suatu cahaya monokromatis dilewatkan melalui suatu media, maka bertambah-turunnya
intensitas cahaya yang ditransmisikan sebanding dengan tebal dan kepekaan media yang digunakan Yanlinastuti, Dian, Fatimah, dan Yusuf, 2011.
Parameter Optical Density OD yang digunakan adalah absorbansi. Seri konsentrasi ditambahkan ke dalam media MHB lalu ditambahkan suspensi bakteri
ke dalam media uji yang telah terdapat ekstrak etanol. Tabung yang berisi media uji MHB, ekstrak etanol dan suspensi bakteri divortex lalu diukur Optical
Density OD menggunakan spekt
rofotometer 480 nm. Tabung yang berisi media, ekstrak etanol kulit batang pohon petai tersebut diinkubasi selama 18-24
jam dengan suhu 37 C dalam inkubator. Setelah 18-24 jam inkubasi, tabung diukur
Optical Density OD menggunakan spektrofotometer 480 nm. Berdasarkan
penelitian yang dilakukan oleh Dewi 2010, panjang gelombang 480 nm menunjukkan bahwa nilai absorbansi terhadap seri konsentrasi kultur bakteri
dengan ketelitian tertinggi dibandingkan dengan panjang gelombang lainnya. Pengukuran Optical Density OD dilakukan sebelum dan setelah inkubasi dimana
selisih dari kedua nilai tersebut digunakan untuk menentukan pertumbuhan bakteri. Jumlah koloni bakteri dapat diukur dengan kekeruhan turbiditas kultur. Semakin
keruh media uji maka makin banyak jumlah bakteri yang tumbuh. Cahaya yang dipancarkan pada spektrofotometer akan mengenai sel bakteri sehingga sebagian
cahaya akan diserap dan sebagian diteruskan. Banyaknya cahaya yang diabsorbsi sebanding dengan banyaknya sel bakteri pada batas-batas tertentu Purwoko, 2007;
Dewi, 2010. Tabel VII adalah data hasil uji kekeruhan dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Data yang ditampilkan pada tabel VII merupakan data
yang paling baik dari ketiga data yang didapatkan.
Tabel VII menunjukkan bahwa konsentrasi 21,875, 25 dan 50 menghasilkan nil
ai ∆OD sebesar nol. Nilai ΔOD nol ini menyatakan bahwa tidak ada perubahan nilai absorbansi sebelum dan setelah inkubasi. Nilai ΔOD ≥ 0
menunjukkan masih terdapat pertumbuhan bakteri dengan meningkatnya nilai absorbansi. Adanya pertumbuhan bakteri berarti menunjukkan konsentrasi ekstrak
etanol tersebut belum mampu menghambat pertumbuhan bakteri. Konsentrasi 21,875, 25 dan 50 dilanjutkan uji penegasan apakah ketiga konsentrasi
tersebut termasuk KHM atau KBM.
Tabel VII. Hasil pengukuran absorbansi pada penentuan KHM dan KBM ekstrak etanol kulit batang pohon petai terhadap bakteri
S. aureus
Kategori