Sebagai hasil dari reaksi hidrolisis tersebut, terbentuk garam-garam basa yang berikatan dengan gugus Na
+
dari NaOH yang terion di dalam air. Asam kafeat yang diinginkan dimungkinkan terbentuk setelah proses pengasaman yang terjadi
pada saat elusi dengan bantuan asam format yang merupakan salah satu komponen fase gerak yang digunakan. Proses Hidrolisis basa dipilih karena beberapa asam
fenolat tidak stabil pada kondisi asam kuat serta dapat menyebabkan senyawa seperti asam hidroksisinamat terdegradasi pada kondisi tersebut serta pada
hidrolisis asam, perbedaan kondisi hidrolisis dapat menyebabkan perbedaan kandungan asam fenolat yang terdeteksi Xu and Howard, 2012.
E. Penentuan Panjang Elusi dan Lama Deteksi
Penentuan panjang elusi perlu dilakukan di dalam sistem KLTKT untuk melihat perbedaan pemisahan yang terjadi ketika terjadi perbedaan panjang elusi.
Pada penelitian ini panjang elusi yang dibandingkan adalah antara panjang elusi 5 cm dengan panjang elusi 8 cm pada hasil hidrolisis ekstraksi menggunakan syphon
tabel VI dan tabel VII dan hasil hidrolisis ekstraksi menggunakan metode seduhan biasa tabel VIII dan tabel IX.
Tabel VI. Nilai Rf, AUC dan lama elusi larutan sampel yang diekstraksi dengan menggunakan syphon serta larutan baku 1 mgmL yang dideteksi pada
325 nm, 330 nm dan 335 nm menggunakan fase gerak toluen : etil asetat : asam format 7 : 2 : 1 pada panjang
jarak elusi 5 cm
Hasil Hidrolisis Ekstraksi Syphon Panjang
Jarak Elusi
cm nm
Sampel Deteksi
Langsung Lama
Elusi menit
Deteksi Setelah 30 Menit
Lama Elusi
menit Rf
AUC Rf
AUC
5 325
Replikasi I 0,16
1797,3
10 0,17
1875,9
10 Replikasi II
0,16 1949,2
0,17 1888,5
Replikasi III 0,16
2511,8 0,17
1847,1 Baku 1
mgmL 0,16
10598,6 0,17
9754,7
330 Replikasi I
0,16 1735,5
0,17 1736,8
Replikasi II 0,16
1890,2 0,17
1781,6 Replikasi III
0,16 2424,1
0,17 1762,2
Baku 1 mgmL
0,16 10197,3
0,17 9233,8
335 Replikasi I
0,16 1653,4
0,17 1717,0
Replikasi II 0,16
1753,9 0,17
1761,0 Replikasi III
0,16 2233,6
0,17 1713,4
Baku 1 mgmL
0,16 9822,6
0,17 9030,4
Perbedaan jarak elusi antara 5 cm dan 8 cm menyebabkan perbedaan R
f
pada saat deteksi. Terlihat pada tabel VI, jarak elusi 5 cm untuk hasil hidrolisis metode ekstraksi menggunakan syphon menghasilkan R
f
yang lebih dekat yaitu 0,16 pada deteksi langsung setelah pengeringan dan 0,17 pada deteksi 30 menit
setelah pengeringan sedangkan pada jarak elusi 8 cm untuk hasil hidrolisis metode ekstraksi menggunakan syphon tabel VII R
f
yang dihasilkan adalah 0,32 – 0,33
pada deteksi langsung setelah pengeringan dan 0,26 – 0,27 pada deteksi 30 menit
setelah pengeringan. Berdasarkan Gandjar dan Rohman 2007 R
f
yang baik adalah yang memiliki pemisahan sekitar 0,2 sampai dengan 0,8 karena itu, jarak elusi 5 cm
tidak memenuhi persyaratan R
f
yang baik untuk pemisahan.
Tabel VII. Nilai Rf, AUC dan lama elusi larutan sampel yang diekstraksi dengan menggunakan syphon serta larutan baku 1 mgmL yang dideteksi pada
325 nm, 330 nm dan 335 nm menggunakan fase gerak toluen : etil asetat : asam
format 7 : 2 : 1 pada panjang jarak elusi 8 cm
Hasil Hidrolisis Ekstraksi Syphon Panj
ang Jara
k Elusi
cm
nm Sampel
Deteksi Langsung
Lama Elusi
menit Deteksi Setelah
30 Menit Lama
Elusi menit
Rf AUC
Rf AUC
8 325
Replikasi I 0,32
3038,40
20 0,26
2672,30
20 Replikasi II
0,32 2749,30
0,26 2883,30
Replikasi III 0,32
3037,30 0,26
2768,70 Baku 1
mgmL 0,33
14248,60 0,27
13780,80
330 Replikasi I
0,32 2848,60
0,26 2652,90
Replikasi II 0,32
2552,70 0,26
2913,80 Replikasi III
0,32 2829,20
0,26 2800,60
Baku 1 mgmL
0,33 13827,90
0,27 13850,60
335 Replikasi I
0,32 2691,30
0,27 2553,80
Replikasi II 0,32
2413,10 0,27
2798,60 Replikasi III
0,32 2617,20
0,26 2707,20
Baku 1 mgmL
0,33 13039,90
0,27 13079,30
Perbandingan R
f
antara jarak elusi 5 cm untuk hasil hidrolisis metode ekstraksi seduhan biasa tabel VIII dengan jarak elusi 8 cm untuk hasil hidrolisis
metode ekstraksi seduhan biasa tabel IX tidak dapat digunakan sebagai penentu karena pada jarak elusi 5 cm, R
f
yang terdeteksi pada 330 nm pada saat deteksi langsung setelah pengeringan adalah 0,42
– 0,45 sedangkan pada jarak elusi 8 cm R
f
yang terdeteksi pada 330 nm pada saat deteksi langsung adalah 0,25 - 0,26. Kemudian pada jarak elusi 5 cm dengan 8 cm pada pendeteksian 30 menit setelah
pengeringan tidak berbeda jauh, yaitu 0,24 – 0,25 untuk jarak elusi 5 cm dan 0,27
untuk jarak elusi 8 cm. Hal tersebut disebabkan karena pembuatan fase gerak yang berbeda-beda untuk setiap elusi.
Tabel VIII. Nilai Rf, AUC dan lama elusi larutan sampel yang diekstraksi dengan diseduh serta larutan baku 1 mgmL yang dideteksi pada
325 nm, 330 nm dan 335 nm menggunakan fase gerak toluen : etil asetat : asam format 7 : 2 : 1 pada panjang
jarak elusi 5 cm
Hasil Hidrolisis Ekstraksi Seduh Panja
ng Jarak
Elusi cm
nm
Sampel Deteksi Langsung
Lama Elusi
menit Deteksi Setelah
30 Menit Lama
Elusi menit
Rf AUC
Rf AUC
5 325
Replikasi I 0,26
1902,40
10 0,24
2011,80
10 Replikasi II
0,26 1838,30
0,24 1938,90
Replikasi III 0,25
1857,20 0,24
1935,80 Replikasi IV
0,25 1784,10
0,24 1942,30
Baku 1 mgmL
0,27 10868,40
0,25 10854,20
330 Replikasi I
0,45 1845,40
0,24 1956,30
Replikasi II 0,44
1801,40 0,24
1837,40 Replikasi III
0,43 1811,10
0,24 1874,20
Replikasi IV 0,42
1680,30 0,24
1911,30 Baku 1
mgmL 0,42
10736,60 0,25
10779,00
335 Replikasi I
0,26 1716,10
0,24 1830,60
Replikasi II 0,26
1663,40 0,24
1757,70 Replikasi III
0,25 1664,50
0,24 1753,20
Replikasi IV 0,25
1582,40 0,24
1833,20 Baku 1
mgmL 0,27
10027,20 0,25
10038,50
Pada proses penentuan panjang elusi ini, fase gerak dibuat sebanyak empat kali. Pertama pada saat panjang elusi 5 cm untuk ekstraksi menggunakan syphon.
Kedua adalah pada saat panjang elusi 8 cm untuk ekstraksi menggunakan syphon. Ketiga adalah pada saat panjang elusi 5 cm untuk ekstraksi menggunakan metode
seduhan. Keempat adalah pada saat 8 cm untuk ekstraksi menggunakan metode seduhan. Masing-masing fase gerak digunakan untuk mengelusi lempeng baik yang
akan digunakan untuk deteksi langsung setelah proses pengeringan maupun lempeng yang akan dideteksi 30 menit setelah pengeringan.
Tabel IX. Nilai Rf, AUC dan lama elusi larutan sampel yang diekstraksi dengan diseduh serta larutan baku 1 mgmL yang dideteksi pada
325 nm, 330 nm dan 335 nm menggunakan fase gerak toluen : etil asetat : asam format 7 : 2 : 1 pada panjang
jarak elusi 8 cm
Hasil Hidrolisis Ekstraksi Seduh Panja
ng Jarak
Elusi cm
nm
Sampel Deteksi Langsung
Lama Elusi
menit Deteksi Setelah
30 Menit Lama
Elusi menit
Rf AUC
Rf AUC
8 325
Replikasi I 0,26
1883,10
20 0,27
1897,40
20 Replikasi II
0,26 1647,10
0,27 1920,30
Replikasi III 0,26
1664,30 0,27
1963,30 Replikasi IV
0,26 1519,60
0,27 1995,30
Baku 1 mgmL
0,26 12826,50
0,27 13382,80
330 Replikasi I
0,25 1751,00
0,27 1760,40
Replikasi II 0,26
1488,90 0,27
1851,60 Replikasi III
0,26 1497,30
0,27 1934,30
Replikasi IV 0,26
1440,80 0,27
1869,30 Baku 1
mgmL 0,26
11727,90 0,27
12259,30
335 Replikasi I
0,26 1723,50
0,27 1780,20
Replikasi II 0,26
1461,80 0,27
1804,20 Replikasi III
0,26 1486,20
0,27 1843,00
Replikasi IV 0,26
1330,70 0,27
1820,60 Baku 1
mgmL 0,26
11993,10 0,27
11974,50
Fase gerak pada penentuan panjang elusi ini dibuat dengan mencampurkan fase gerak secara langsung ke dalam labu takar 50 mL dengan menggunakan pipet
volume dengan ukuran yang berbeda-beda sesuai jumlah yang telah ditentukan sebelumnya. Selama proses pengambilan larutan-larutan fase gerak dengan
menggunakan pipet, volume pengambilan dapat berbeda-beda dan dapat menyebabkan perbedaan polaritas yang dapat terjadi karena fase gerak polar yang
terlalu banyak maupun karena fase gerak non polar yang terlalu banyak. Untuk menghindari perbedaan polaritas yang dapat menyebabkan bias pada saat
pengukuran, maka pembuatan fase gerak pada elusi selanjutnya dilakukan dengan menuangkan larutan-larutan fase gerak terlebih dahulu ke dalam gelas ukur
sejumlah yang telah ditentukan kemudian dimasukkan ke dalam Erlenmayer bertutup untuk kemudian dihomogenkan dengan penggojogan.
Setelah proses elusi, lempeng dikeringkan dengan cara pemanasan di dalam oven pada suhu 50
C selama 5 menit dengan tujuan untuk mengeringkan lempeng dan menguapkan pelarut sehingga diharapkan yang terdeteksi di lempeng
hanya analit yang telah terelusi saja. Pendeteksian lempeng yang lebih kering akan mengurangi noise yang mungkin muncul karena pelarut Ranny, 1952.
Pada bagian ini juga dilihat perbedaan pendeteksian langsung setelah lempeng dikeringkan dengan deteksi 30 menit setelah pengeringan. Berdasarkan
tabel VI dan tabel VII serta tabel VIII dan tabel IX, perbedaan selang waktu deteksi tidak memberikan pengaruh berarti pada kadar yang terdeteksi tidak terjadi
penurunan kadar. Akan tetapi, terjadi pergeseran R
f
puncak antara hasil dideteksi langsung dengan hasil dideteksi 30 menit setelah pengeringan. Hal ini dapat
disebabkan karena suhu ruangan saat proses elusi, kelembaban udara di sekitar chamber
, serta tekanan di dalam chamber tidak dapat dikontrol selama proses elusi. Meskipun hasil pendeteksian langsung dan pendeteksian 30 menit setelah
pengeringan tidak menunjukkan perubahan yang dapat mengganggu proses perhitungan kadar, untuk keefisienan waktu, deteksi pada proses selanjutnya tetap
dilakukan langsung setelah proses pengeringan. Pendeteksian dilakukan pada panjang gelombang yang berbeda untuk
membandingkan profil kurva yang terbentuk serta serapan yang dihasilkan pada panjang gelombang mana yang lebih baik serta untuk melihat pada panjang
gelombang mana noise yang terdeteksi lebih sedikit. Panjang gelombang pengamatan yang digunakan adalah 325 nm, 330 nm, dan 335 nm.
F. Optimasi Fase Gerak pada Pemisahan Asam Kafeat Hasil Hidrolisis
