4. Hidrolisis sampel
Sampel hasil kedua ekstraksi 3a dan 3b serta replikasinya dipanaskan di atas waterbath bersuhu ± 85
C selama 15 menit dengan sebelumnya diukur pHnya menggunakan pH meter. Masing-masing sampel kemudian ditambahkan 4 mL
larutan NaOH 1 N. Kemudian dipanaskan kembali selama 15 menit di atas waterbath
. Setelah itu, masing-masing sampel dan replikasinya diukur kembali pHnya menggunakan pH meter sampai pH ±12 Checker
®
HI 1270.
5. Penentuan panjang elusi
Sampel hasil hidrolisis beserta ketiga replikasinya serta larutan baku 1 mgmL, masing-masing ditotolkan ke atas lempeng KLTKT sebanyak 1,0
L menggunakan Autosampler Camag KLT aplikator, Linomat 5 dengan kecepatan
penotolan 30 nLsec pada lempeng KLTKT silika gel 60 F
254
dengan panjang totolan 6 mm dan penotolan diposisikan 15 mm dari bagian bawah lempeng dan 15
mm dari bagian samping lempeng yang kemudian dikembangkan dalam bejana kromatografi dengan fase gerak toluen p.a. : etil asetat p.a.: asam format p.a.
7 : 2 : 1. Volume fase gerak yang digunakan adalah 50 mL. Pengembangan dilakukan setinggi 5 cm dan 8 cm. Lempeng KLTKT silika gel 60 F
254
kemudian dikeluarkan dan dikeringkan di dalam oven bersuhu ± 50
C selama 5 menit. Bercak dideteksi pada panjang gelombang 330 nm Rivelli et al., 2007, 325 nm dan 335
nm dengan menggunakan densitometer Camag KLT Scanner 3.
6. Optimasi metode KLTKT-Densitometri
a. Pembuatan fase gerak
Masing-masing fase gerak yang digunakan, diambil dengan perbandingan voume dan jenis fase gerak seperti yang tertera pada tabel IV dan dicampur dalam
erlenmeyer bertutup kemudian digojog, yaitu:
Tabel IV. Jenis dan komposisi fase gerak
Campuran Fase Gerak
Kloroform p.a
mL Toluen p.a
mL Etil asetat
p.a mL
Asam format p.a
mL Komposisi 1
35 -
10 5
Komposisi 2 -
25 15
10 Komposisi 3
- 35
10 5
b. Optimasi pemisahan asam kafeat dalam larutan ekstrak biji kopi
1 Larutan baku asam kafeat 1 mgmL beserta sampel dari masing-
masing ekstraksi yang telah dihidrolisis pelarut aquadest panas, ditotolkan sebanyak 2,0
L menggunakan Autosampler Camag KLT aplikator, Linomat 5 dengan kecepatan penotolan 50 nLsec pada lempeng KLT silika gel 60 F
254
dengan panjang totolan 6 mm. Lempeng silika segera dikembangkan dalam bejana
kromatografi yang telah dijenuhi dengan menggunakan fase gerak yang telah dibuat sesuai dengan komposisi 1 pada tabel IV. Setelah mencapai jarak elusi 8 cm,
Lempeng KLT silika gel 60 F
254
dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan di dalam oven
bersuhu ± 50 C selama lima menit. Bercak yang muncul dideteksi pada
panjang gelombang 330 nm Rivelli et al., 2007 dengan menggunakan densitometer Camag KLT Scanner 3.
2 Larutan baku asam kafeat 1 mgmL beserta sampel dari masing-
masing ekstraksi yang telah dihidrolisis pelarut aquadest panas, ditotolkan sebanyak 2,0
L menggunakan Autosampler Camag KLT aplikator, Linomat 5 dengan kecepatan penotolan 50 nLsec pada lempeng KLT silika gel 60 F
254
dengan panjang penotolan 4 mm. Lempeng silika segera dikembangkan dalam bejana
kromatografi yang telah dijenuhi dengan menggunakan fase gerak yang telah dibuat sesuai dengan komposisi 2 pada tabel IV. Setelah mencapai jarak elusi 8 cm,
Lempeng KLT silika gel 60 F
254
dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan di dalam oven
bersuhu ± 50 C selama lima menit. Bercak yang muncul dideteksi pada
panjang gelombang 330 nm Rivelli et al., 2007 dengan menggunakan densitometer Camag KLT Scanner 3.
3 Larutan baku asam kafeat 0,08; 0,13; 0,18; 0,23; 0,28; dan 0,33
mgmL beserta sampel hasil hidrolisis ditotolkan sebanyak 1,0
L menggunakan Autosampler
Camag KLT aplikator, Linomat 5 dengan kecepatan penotolan 30 nLsec pada lempeng KLTKT silika gel 60 F
254
dengan panjang totolan 6 mm. Lempeng silika segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah
dijenuhi dengan menggunakan fase gerak yang telah dibuat sesuai dengan komposisi 3 pada tabel IV. Setelah mencapai jarak elusi 8 cm, Lempeng KLTKT
silika gel 60 F
254
dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan di dalam oven bersuhu ± 50
C selama lima menit. Bercak yang muncul dideteksi pada panjang gelombang 330 nm Rivelli et al., 2007 dengan menggunakan densitometer Camag KLT
Scanner 3 .
c. Ripitabilitas fase gerak hasil optimasi
Larutan baku asam kafeat 0,08; 0,13; 0,18; 0,23; 0,28; dan 0,33 mgmL direplikasi sebanyak tiga kali beserta sampel hasil hidrolisis dan ketiga replikasinya
ditotolkan sebanyak 1,0
L menggunakan Autosampler Camag KLT aplikator, Linomat 5 dengan kecepatan penotolan 30 nLsec pada lempeng KLTKT silika gel
60 F
254
dengan besar penotolan 6 mm. Lempeng silika segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi dengan menggunakan densitometer Camag
KLT Scanner 3.menggunakan fase gerak hasil optimasi hingga mencapai jarak elusi 8 cm, Lempeng KLTKT silika gel 60 F
254
dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan di dalam oven bersuhu 50
C selama lima menit. Bercak yang muncul dideteksi pada panjang gelombang 330 nm Rivelli et al., 2007 325 nm dan 335
nm dengan menggunakan densitometer Camag KLT Scanner 3. Parameter optimal dihitung berdasarkan nilai faktor retardasi R
f ;
nilai faktor asimetris A
s
dan KV nilai AUC.
G. Analisis Hasil
Kategori