senyawa lain yang memiliki kepolaran yang mirip dengan asam kafeat maupun senyawa-senyawa yang cenderung non polar sehingga puncak yang dihasilkan
belum terpisah dengan baik meskipun asam kafeat sudah dapat terdeteksi. Asam kafeat sudah dapat dikatakan terdeteksi karena memiliki R
f
yang berdekatan dengan baku 0,72 yaitu 0,74 - 0.76. Berdasarkan hasil elusi di atas maka fase gerak ini
tidak digunakan untuk analisis kuantitatif dalam pemisahan asam kafeat. 2.
Hasil elusi asam kafeat dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format 5 : 3 : 2
Fase gerak ini berdasarkan penelitian
Rastogi et al. 2008
untuk pemisahan asam fenolat di dalam tanaman Syzygium aromaticum namun dengan modifikasi pada
komposisinya. Densitogram yang dihasilkan pada elusi menggunakan fase gerak ini adalah sebagai berikut:
Gambar 12. Puncak baku asam kafeat dan sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon dan seduh pada
330 nm dengan fase diam silica gel 60 F
254
dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format 5 : 3 : 2
A. Asam kafeat yang terdeteksi pada hasil hidrolisis ekstraksi syphon R
f
,48 B.
Asam kafeat yang terdeteksi pada hasil hidrolisis ekstraksi seduh R
f
0,47 C.
Baku asam kafeat 1 mgmL R
f
0,48
A B
C
Hasil densitogram yang pada elusi menggunakan fase gerak ini menunjukkan pemisahan antara asam kafeat dengan senyawa lain di dalam matriks
sampel lebih baik meskipun pemisahkan masih belum mencapai garis baseline. Pemisahan yang cukup baik antara asam kafeat dengan senyawa di sekitarnya
disebabkan karena sifat toluen sebagai fase gerak yang memiliki sifat non polar yang lebih tinggi dibandingkan dengan kloroform pada komposisi fase gerak
sebelumnya sehingga dapat memisahkan senyawa-senyawa non polar yang terdapat di dalam matriks sampel dari asam kafeat yang bersifat relatif polar.
Penyebab tidak baselinenya pemisahan serta masih banyaknya pengotor di sekitar puncak asam kafeat gambar 12 A dan 12 B dapat disebabkan karena
penotolan dilakukan sepanjang 4 mm dan sebanyak 2
L sehingga dengan jumlah penotolan yang terlalu banyak membuat pemisahan tidak sempurna. Selain itu,
jumlah toluen yang digunakan untuk pemisahan pada komposisi fase gerak ini masih belum cukup untuk dapat memisahkan asam kafeat dari senyawa-senyawa
lain pada matriks sampel karena sistem masih cenderung polar meskipun asam kafeat telah dapat terdeteksi yang dapat dilihat dari R
f
yang dihasilkan yaitu 0,47 –
0,48 dengan R
f
pada baku yaitu 0,48. Berdasarkan hasil elusi di atas maka fase gerak tidak digunakan untuk proses analisis selanjutnya.
3.
Hasil elusi asam kafeat dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format 7 : 2 : 1
Fase gerak ini merupakan modifikasi fase gerak II untuk menurunkan kepolaran dari fase gerak dengan menambahkan jumlah toluen untuk dapat
memisahkan asam kafeat. Pada optimasi menggunakan fase gerak ini, dilakukan
pergantian pelarut menggunakan aquabidest untuk mengurangi pengotor yang disebabkan oleh pelarut. Berikut ini adalah densitogram yang dihasilkan pada elusi
menggunakan fase gerak ini.
Gambar 13. Puncak baku asam kafeat dan sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon dan seduh
pada 330 nm dengan fase diam silica gel 60 F
254
dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format 7 : 2 : 1
A.
Asam kafeat yang terdeteksi pada hasil hidrolisis ekstraksi syphon R
f
0,34 B.
Asam kafeat yang terdeteksi pada hasil hidrolisis ekstraksi seduh R
f
0,33 C.
Baku asam kafeat 1 mgmL R
f
0,34
Berdasarkan kromatogram pada gambar 13 yang dihasilkan dari proses elusi menggunakan fase gerak toluen : etil asetat : asam format 7 : 2 : 1 dapat
terlihat tidak ada lagi puncak lain di sekitar puncak asam kafeat serta nilai R
f
dari baku adalah 0,34 dan R
f
dari elusi sampel dari kedua macam ekstraksi adalah 0,33 - 0,34. Hasil tersebut menandakan komposisi fase gerak ini telah dapat memisahkan
asam kafeat dengan baik dari matriks sampel. Selain itu, penggunaan aquabidest sebagai pelarut juga telah mengurangi jumlah pengotor yang dapat menyebabkan
munculnya puncak-puncak yang tidak diinginkan. Penambahan jumlah toluen pada
A
B
C
fase gerak telah menurunkan kepolaran dari fase gerak sehingga senyawa yang bersifat non polar akan terelusi bersama dengan fase gerak dan asam kafeat yang
bersifat lebih polar akan tertahan di lempeng silika.
4.
Hasil elusi asam kafeat dengan fase gerak toluene : etil asetat : asam format 7 : 2 : 1 pada lempeng KLTKT
Setelah ditemukan komposisi fase gerak yang optimal untuk memisahkan asam kafeat dari matriks sampel hasil hidrolisis ekstrak biji kopi arabika, penotolan
dilakukan di lempeng KLTKT untuk memastikan bahwa fase gerak yang telah ditentukan juga dapat digunakan pada lempeng KLTKT. Berikut adalah
densitogram hasil elusi menggunakan fase gerak toluen : etil asetat : asam format 7 : 2 : 1 pada lempeng KLTKT
Gambar 14. Puncak baku asam kafeat dan sampel hasil hifrolisis ekstraksi syphon dan seduh pada
330 nm dengan fase diam silica gel 60 F
254
dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format 7 : 2 : 1 pada plat KLTKT
A.
Asam kafeat yang terdeteksi pada hasil hidrolisis ekstraksi syphon R
f
0,32 B.
Asam kafeat yang terdeteksi pada hasil hidrolisis ekstraksi seduh R
f
0,26 C.
Baku asam kafeat 1 mgmL R
f
0,33
B A
C
Kromatogram yang dihasilkan menggunakan fase gerak fase gerak toluen : etil asetat : asam format 7 : 2 : 1 pada lempeng KLTKT gambar 14
menunjukkan bahwa fase gerak ini dapat digunakan sebagai eluen untuk pemisahan asam kafeat dari matriks sampel dan menghasilkan pemisahan yang cukup baik
ditandai dengan tidak nampaknya puncak lain di sekitar puncak asam kafeat. R
f
yang dihasilkan berdasarkan elusi menggunakan fase gerak ini adalah 0,26 – 0,33
Pemisahan dapat terjadi karena interaksi yang terbentuk antara asam kafeat dengan fase diam dan fase gerak. Gugus polar dalam asam kafeat akan berinteraksi
dengan sisi polar pada lempeng silika gel 60 F
254
yang memiliki gugus silanol Si- OH dan gugus siloksan Si-O-Si pada permukaannya. Berikut ini adalah interaksi
antara asam kafeat dengan fase diam.
Gambar 15. Interaksi asam kafeat dengan fase diam ----- Interaksi hidrogen
Asam kafeat yang memiliki sifat polar membentuk ikatan hidrogen dengan fase diam seperti terlihat pada gambar 15 sehingga asam kafeat lebih cenderung
tertahan lebih kuat terikat pada fase diam sehingga diperlukan fase gerak yang lebih non polar untuk menarik asam kafeat agar terpisah dari matriks sampel dan
membentuk pemisahan yang baik. Berikut adalah interaksi yang terjadi antara asam kafeat dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format.
Gambar 16. Interaksi asam kafeat dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format
------ Interaksi hidrogen Interaksi Van Der Waals
Interaksi antara asam kafeat dengan fase gerak gambar 16 yang terbentuk cukup kuat ditunjukkan melalui ikatan-ikatan hidrogen yang terbentuk antara fase
gerak dengan gugus polar dari asam kafeat serta dibantu oleh toluen dengan jumlah yang cukup banyak serta dengan sifatnya yang paling non polar diantara ketiga jenis
fase gerak yang digunakan, dapat menarik asam kafeat sehingga terpisah dari matriks sampel.
5.
Ripitabilitas baku asam kafeat serta sampel pada fase gerak toluen : etil asetat : asam format 7 : 2 : 1 pada lempeng KLTKT
Setelah didapatkan komposisi fase gerak yang optimal dilakukan pengujian ripitabilitas pemisahan baku asam kafeat dan sampel dengan menggunakan fase
gerak toluen : etil asetat : asam format 7 : 2 : 1. Hasil pengujian ripitabilitas ini juga digunakan untuk pembuatan kurva baku yang diikuti dengan perhitungan
kadar asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika. Uji ripitabilitas ini digunakan untuk melihat sudah konstan atau belumnya keterulangan
pengukuran asam kafeat menggunakan fase gerak yang telah ditentukan terhadap kedua jenis ekstraksi melalui pengamatan kestabilan keterulangan nilai R
f
, nilai As.
Berikut adalah penjabaran hasil elusi baku asam kafeat pada panjang gelombang 325 nm, 330 nm dan 335 nm.
Tabel X. Nilai
R
f
, As, dan AUC dari seri larutan baku asam kafeat dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format 7 : 2 : 1 yang dideteksi pada
325 nm 325 nm
Replikasi I Konsentrasi
0,08 0,13
0,18 0,23
0,28
Rf
0,28 0,28
0,28 0,28
0,29
As
0,64 0,89
0,50 0,47
0,54 AUC
1281,20 1983,30 2854,40 3410,70 4093,90
Replikasi II Konsentrasi
0,08 0,13
0,18 0,23
0,28
Rf
0,25 0,25
0,25 0,26
0,26
As
0,70 0,54
0,64 0,54
0,57 AUC
1025,80 1775,50 2618,70 3321,50 4085,70
Replikasi III Konsentrasi
0,08 0,13
0,18 0,23
0,28
Rf
0,32 0,32
0,32 0,32
0,32
As
0,67 0,45
0,5 0,5
0,5 AUC
1081,20 1889,90 2646,40 3218,50 4158,30
Berdasarkan data yang ditampilkan pada tabel X, XI, dan XII seluruh puncak baku asam kafeat yang dihasilkan menunjukkan peningkatan respon
detektor densitometer seiring pertambahan jumlah konsentrasi yang terlihat dari peningkatan nilai AUC yang terbaca. Akan tetapi, dari nilai As yang dihasilkan,
tampak bahwa puncak asam kafeat yang dihasilkan membentuk fronting. Hal ini dapat disebabkan karena pelarut yang digunakan tidak sesuai dengan fase gerak
pada saat mengelusi sampel selain itu bisa juga karena pH fase gerak kurang tepat sehingga menyebabkan fronting pada puncak asam kafeat.
Tabel XI. Nilai
R
f
, As, dan AUC dari seri larutan baku asam kafeat dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format 7 : 2 : 1 yang dideteksi pada
330 nm 330 nm
Replikasi I Konsentrasi
0,08 0,13
0,18 0,23
0,28
Rf 0,28
0,28 0,28
0,28 0,29
As 0,46
0,50 0,50
0,55 0,58
AUC 1206,10 1945,10 2737,60 3380,00 4092,50
Replikasi II Konsentrasi
0,08 0,13
0,18 0,23
0,28
Rf 0,25
0,25 0,25
0,25 0,26
As 0,58
0,53 0,62
0,63 0,53
AUC 961,10
1721,20 2457,40 3095,60 3742,20
Replikasi III Konsentrasi
0,08 0,13
0,18 0,23
0,28
Rf 0,32
0,32 0,32
0,32 0,32
As 0,67
0,56 0,5
0,55 0,5
AUC 1016,30 1727,20 2695,20 3287,00 4005,50
Akan tetapi dapat dipastikan bahwa fronting bukan disebabkan karena terdapat puncak lain yang tidak terpisah dengan puncak asam kafeat karena pembuatan
larutan baku asam kafeat berasal dari serbuk asam kafeat dengan kemurnian tinggi yaitu ≥ 98.
Tabel XII. Nilai
R
f
, As, dan AUC dari seri larutan baku asam kafeat dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format 7 : 2 : 1 yang dideteksi pada
335 nm 335 nm
Replikasi I Konsentrasi
0,08 0,13
0,18 0,23
0,28
Rf 0,28
0,28 0,28
0,28 0,29
As 0,43
0,45 0,44
0,54 0,57
AUC 1118,90 1785,00 2578,70 3127,50 3789,60
Replikasi II Konsentrasi
0,08 0,13
0,18 0,23
0,28
Rf 0,25
0,25 0,25
0,26 0,26
As 0,60
0,55 0,62
0,55 0,62
AUC 867,90
1479,40 2271,80 2705,30 3411,10
Replikasi III Konsentrasi
0,08 0,13
0,18 0,23
0,28
Rf 0,32
0,32 0,32
0,32 0,32
As 0,57
0,45 0,71
0,55 0,63
AUC 987,30
1692,80 2464,70 3030,70 3690,90
Profil puncak asam kafeat yang terdeteksi pada sampel tabel XIII juga mengalami fronting
, meskipun kadarnya relatif kecil. Berikut ini adalah tabel data hasil elusi sampel hasil kedua ekstraksi biji kopi arabika pada panjang gelombang 325 nm,
330 nm dan 335 nm.
Tabel XIII. Nilai
R
f
, As, dan AUC dari larutan sampel hasil hidrolisis ekstraksi biji kopi arabika dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format 7 : 2 : 1
Sampel Hasil Hidrolisis Ekstraksi Syphon 325 nm
330 nm 335 nm
RF As
AUC RF
As AUC
RF As
AUC Replikasi I
0,30 0,57 1960,00 0,30 0,53 1955,20
0,30 0,57 1790,10
Replikasi II 0,29 0,53 1887,50 0,28 0,57
1887,20 0,29 0,58 1682,10
Replikasi III 0,28 0,47 1855,90 0,28 0,50
1855,40 0,28 0,57 1646,60
Replikasi IV 0,28 0,47 1809,20 0,28 0,50
1821,80 0,28
0,4 1652,60
Sampel Hasil Hidrolisis Ekstraksi Seduh 325 nm
330 nm 335 nm
RF As
AUC RF
As AUC
RF As
AUC Replikasi I
0,26 0,62 1905,40 0,26 0,57 1793,10
0,26 0,62 1620,60
Replikasi II
0,25 0,64 1983,70 0,25 0,33 1837,80
0,25 0,64 1703,70
Replikasi III 0,25 0,64 1870,20 0,25 0,62
1796,60 0,25 0,54 1603,50
Replikasi IV
0,25 0,57 1844,00 0,25 0,33 1684,10
0,25 0,62 1566,90
Nilai R
f
yang dihasilkan dari proses elusi baku dan sampel, menunjukkan keterulangan yang baik dengan R
f
antara satu penotolan dengan penotolan lain yaitu 0,25
– 0,32 akan tetapi antar replikasi menunjukkan perbedaan R
f
perbedaan ini dapat disebabkan karena perbedaan suhu ruangan saat proses elusi, kelembaban
udara di sekitar chamber, serta tekanan di dalam chamber tidak dapat dikontrol selama proses elusi.
G. Pembuatan Kurva Baku Asam Kafeat
