senyawa-senyawa non polar di dalam matriks sampel oleh toluen dapat menghasilkan pemisahan yang baik.
Etil asetat dipilih sebagai komponen fase gerak karena sifatnya yang semi polar dapat menarik asam kafeat dari matriks sampel agar ikut terelusi pada
lempeng silika dan tidak tertahan pada matriks sampel sehingga dapat terdeteksi. Pemilihan ini juga didasarkan pada sifat asam kafeat yang cenderung polar sehingga
lebih mudah terelusi oleh etil asetat yang bersifat semi polar. Asam format dipilih sebagai fase gerak karena struktur asam format yang
dapat membentuk ikatan hidrogen. Seperti yang dikatakan oleh Galanakis et al.
2013 bahwa kecenderungan senyawa fenolik untuk membentuk ikatan berdasarkan stereokimianya dan ikatan yang sering muncul adalah ikatan hidrogen
dengan senyawa pelarutnya sehingga asam kafeat yang merupakan senyawa fenolik akan lebih mudah terbawa oleh asam format karena ikatan hidrogen yang terbentuk
diantara kedua senyawa tersebut.
B. Pembuatan Seri Larutan Baku
Pembuatan larutan baku dilakukan dengan melarutkan baku asam kafeat dengan kemurnian ≥ 98.0 ke dalam pelarut aquabidest panas. Penggunaan
aquabidest panas sebagai pelarut karena asam kafeat dapat larut di dalam aquabidest panas dan untuk menyamakan pelarut yang digunakan pada sampel yang diuji.
Pemilihan aquabidest sebagai pelarut dengan pertimbangan kemurnian air aquabidest lebih tinggi dibandingkan dengan aquadest sehingga diharapkan dapat
mengurangi pengotor yang ikut muncul pada saat pendeteksian yang dapat
mengganggu proses analisis karena kemunculan pengotor yang terdeteksi pada detektor dapat menyebabkan pengukuran menjadi kurang sensitif.
Tujuan pembuatan larutan baku adalah untuk memastikan analit yang akan dianalisis benar berada di dalam matriks sampel. Caranya dengan membandingkan
puncak hasil serapan baku dengan sampel yang muncul setelah proses elusi. Serta untuk melakukan penetapan kadar analit yang berada di dalam matriks sampel yaitu
dengan pembuatan seri konsentrasi larutan baku. Larutan baku asam kafeat dibuat dengan konsentrasi 1 mgmL yang
kemudian diencerkan untuk membuat seri konsentrasi larutan baku. Pemilihan konsentrasi 1 mgmL karena belum diketahuinya jumlah analit di dalam matriks
sampel yang mungkin terdeteksi sehingga diperlukan konsentrasi yang agak besar agar analit di dalam matriks sampel dapat dipastikan merupakan analit yang
diinginkan. Seri konsentrasi larutan baku yang pertama kali dibuat adalah 0,03; 0,05;
0,08; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,28; dan 0,3 mgmL. Seri konsentrasi tersebut dibuat dengan tujuan untuk melihat konsentrasi terkecil yang masih dapat dideteksi oleh
TLC Scanner serta untuk menentukan konsentrasi yang dapat digunakan untuk membuat kurva baku. Penentuan seri konsentrasi didasarkan pada analit yang
terdeteksi pada saat orientasi.
Gambar 9. Kromatogram seri larutan baku yang diukur pada 330 nm dengan fase gerak
toluen : etil asetat : asam format 7 : 2 : 1 dari depan trek 1 0,03; trek 2 0,05; trek 3 0,08; trek 4 0,1; trek 5 0,15; trek 6 0,2; trek 7 0,25; trek 8 0,28;
dan trek 9 0,3 mgmL
Pendeteksian seri konsentrasi baku asam kafeat dilakukan pada 330 nm
tabel V, Berdasarkan pendeteksian tersebut, konsentrasi 0,03 mgmL trek 1; gambar 9; tabel V tidak dapat terdeteksi dan konsentrasi 0,05 mgmL trek 2; tabel
V terdeteksi sangat kecil sehingga pada pembuatan seri konsentrasi yang akan digunakan untuk pembuatan kurva baku, konsentrasi 0,03 dan 0,05 mgmL tidak
lagi digunakan.
Tabel V.
R
f
dan AUC dari seri larutan baku yang diukur pada 330 nm dengan fase gerak
toluen : etil asetat : asam format 7 : 2 : 1 trek 1 0,03; trek 2 0,05; trek 3 0,08; trek 4 0,1; trek 5 0,15; trek 6 0,2; trek 7 0,25; trek 8 0,28; dan trek 9 0,3
mgmL
Track Peak
Max Position Max Height
Area 2
1 0,26 Rf
23,3 AU 715,1 AU
3 1
0,27 Rf 42,9 AU
1228,7 AU 4
1 0,27 Rf
55,0 AU 1560,6 AU
5 1
0,26 Rf 57,0 AU
1592,5 AU 6
1 0,26 Rf
85,2 AU 2411,9 AU
7 1
0,26 Rf 99,8 AU
2691,3 AU 8
1 0,27 Rf
124,3 AU 3417,4 AU
9 1
0,27 Rf 127,1 AU
3520,5 AU
Pada konsentrasi 0,08 mgmL trek 3 dan konsentrasi 0,1 mgmL trek 4 AUC yang terbaca menunjukkan angka yang kurang lebih sama. Padahal
seharusnya dengan adanya perbedaan konsentrasi sebanyak 0,02 mgmL, AUC yang terbaca pada konsentrasi 0,08 mgmL seharusnya lebih kecil dibandingkan
dengan AUC yang terbaca pada konsentrasi 0,1 mgmL. Penyebab kesalahan pengukuran ini karena pipet yang digunakan untuk membuat konsentrasi 0,08
mgmL dari larutan stok 1 mgmL adalah mikropipet sedangkan untuk konsentrasi 0,1 mgmL adalah makropipet sehingga pada pembuatan seri konsentrasi yang akan
digunakan untuk pembuatan kurva baku, pipet yang digunakan hanya makropipet untuk seluruh seri konsentrasi. Seri konsentrasi yang kemudian digunakan untuk
pembuatan kurva baku adalah 0,08, 0,13, 0,18, 0,23, dan 0,28 mgmL yang didasarkan pada respon analit di dalam sampel yang didapat saat orientasi.
C. Preparasi Larutan Sampel
