Pada konsentrasi 0,08 mgmL trek 3 dan konsentrasi 0,1 mgmL trek 4 AUC yang terbaca menunjukkan angka yang kurang lebih sama. Padahal
seharusnya dengan adanya perbedaan konsentrasi sebanyak 0,02 mgmL, AUC yang terbaca pada konsentrasi 0,08 mgmL seharusnya lebih kecil dibandingkan
dengan AUC yang terbaca pada konsentrasi 0,1 mgmL. Penyebab kesalahan pengukuran ini karena pipet yang digunakan untuk membuat konsentrasi 0,08
mgmL dari larutan stok 1 mgmL adalah mikropipet sedangkan untuk konsentrasi 0,1 mgmL adalah makropipet sehingga pada pembuatan seri konsentrasi yang akan
digunakan untuk pembuatan kurva baku, pipet yang digunakan hanya makropipet untuk seluruh seri konsentrasi. Seri konsentrasi yang kemudian digunakan untuk
pembuatan kurva baku adalah 0,08, 0,13, 0,18, 0,23, dan 0,28 mgmL yang didasarkan pada respon analit di dalam sampel yang didapat saat orientasi.
C. Preparasi Larutan Sampel
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika Coffea arabica L.. Ekstrak air seduhan tersebut
diperoleh dengan dua cara ekstraksi antara lain dengan metode decoction dan infusi. Kedua jenis metode ekstraksi ini menggunakan aquabidest panas sebagai pelarut
dengan tujuan agar hasil yang didapat semirip mungkin dengan metode pembuatan kopi yang biasa disajikan oleh masyarakat. Pemilihan aquabidest sebagai pelarut
juga dikarenakan asam klorogenat yang merupakan bentuk ester dari asam kafeat Patra, 2012 dihasilkan cukup banyak di dalam air dibanding senyawa fenolik lain
Ohno et al., 2012.
Prinsip infusion pada penelitian ini dilakukan dengan mengekstraksi serbuk kopi menggunakan syphon coffee maker dimana serbuk kopi yang telah
ditimbang dimasukkan ke dalam syphon setelah suhu aquabidest mencapai ± 95 C
dan dibiarkan selama satu menit dalam keadaan mendidih tersebut baru kemudian disaring dan ditunggu sampai dingin. Pada prinsip decoction, aquabidest
dipanaskan di atas kompor sampai suhu ± 95 C kemudian kompor dimatikan.
Serbuk kopi diekstraksi pada air panas tersebut sambil diaduk selama 30 menit kemudian dibiarkan mendingin.
D. Hidrolisis
Asam kafeat di dalam ekstrak biji kopi, tidak dapat langsung ditemukan, sehingga diperlukan proses hidrolisis dari bentuk ester asam kafeat yaitu asam
klorogenat untuk mendapatkan asam kafeat dalam bentuk bebas. Hidrolisis yang digunakan pada penelitian ini adalah hidrolisis basa yang mengacu pada penelitian
Wang et al. 2009 dengan modifikasi. Basa yang digunakan untuk proses hidrolisis adalah NaOH 1N dengan bantuan pemanasan menggunakan waterbath. Reaksi
hidrolisis yang terjadi pada asam klorogenat untuk membentuk asam kafeat ditunjukkan pada gambar 10.
Gambar 10. Reaksi hidrolisis asam klorogenat menjadi natrium kuinat dan asam kafeat
Sebagai hasil dari reaksi hidrolisis tersebut, terbentuk garam-garam basa yang berikatan dengan gugus Na
+
dari NaOH yang terion di dalam air. Asam kafeat yang diinginkan dimungkinkan terbentuk setelah proses pengasaman yang terjadi
pada saat elusi dengan bantuan asam format yang merupakan salah satu komponen fase gerak yang digunakan. Proses Hidrolisis basa dipilih karena beberapa asam
fenolat tidak stabil pada kondisi asam kuat serta dapat menyebabkan senyawa seperti asam hidroksisinamat terdegradasi pada kondisi tersebut serta pada
hidrolisis asam, perbedaan kondisi hidrolisis dapat menyebabkan perbedaan kandungan asam fenolat yang terdeteksi Xu and Howard, 2012.
E. Penentuan Panjang Elusi dan Lama Deteksi
