kromatografi fase normal dimana fase diam akan cenderung lebih polar dibandingkan dengan fase gerak. Fase diam polar yang biasa digunakan antara lain
alumina serta silika dengan fase gerak seperti heksan ataupun propileter. Tipe kedua adalah kromatografi fase terbalik dimana fase diam akan cenderung lebih non-polar
dibandingkan dengan fase gerak. Fase diam non polar yang biasa digunakan antara lain adalah hidrokarbon dengan fase gerak yang relatif polar seperti air, metanol,
atau asetonitril Skoog, 1986. Pada kromatografi fase normal, komponen yang bersifat non polar akan
terbawa fase gerak terlebih dahulu. Sebaliknya, pada kromatgrafi fase terbalik, komponen yang bersifat lebih polar akan cenderung terbawa oleh fase gerak
terlebih dahulu Skoog, 1986.
1. Fase Diam
Pada KLTKT, fase diam yang digunakan berukuran sangat halus serta memiliki pori-pori seragam serta ketebalan lapisannya hanya 0,1 mm, ukuran
partikel fase diam pada KLTKT juga lebih kecil, dan juga lebih tipis. Sampel yang digunakan untuk penotolan hanya sedikit. Bercak penotolannya berdiameter antara
0,1-0,5 mm sehingga dengan lempeng 10 x 10 saja sudah dapat melakukan analisis. Pada KLTKT resolusi pemisahan sudah dapat terlihat jelas pada jarak
pengembangan sampel antara 3-6 cm yang menunjukkan pemisahan yang lebih cepat, mengurangi zona difusi, efisiensi pemisahan yang lebih baik, batas deteksi
yang lebih kecil, dan dapat menotolkan banyak sampel dalam satu lempeng Gandjar dan Rohman, 2007; Sherma and Fried, 1996.
Tabel II. Jenis fase diam yang digunakan pada tahun 1979-1985 Spangernberg, Poole, and Weins, 2011
Dalam sistem KLTKT fase diam yang biasa digunakan adalah uncoated silica gel
. Fase diam lain selain silica gel adalah aluminium oksida, kieselguhr, magnesium oksida dan magnesium silica Florisil® juga merupakan fase diam
yang sering digunakan dalam KLT Spangernberg et al., 2011.
Gambar 4. Struktur Silika gel Eastman, 2010 Tabel III. Karakteristik lempeng yang biasa digunakan dalam KLT Spangernberg et al.,
2011
Parameter TLC
HPTLC UTLC
ukuran lempeng cm 20 x 20
10 x 10 6 x 3,6
ketebalan lempeng m
100 –250 100–200
10 ukuran partikel
m 8
–10 6
–8 -
volume penotolan mL 1
–5 0,1-5
0,01-0,1 jarak pemisahan cm
6-15 3-7
1-3 maksimal diameter penotolan mm
3 –6
1 –1,5
0,5 –1
waktu pemisahan menit 30
–200 3
–20 1
–5 tinggi lempeng
m 35
–75 23
–25 -
totolan per lempeng 10
9 –18
6 limit deteksi dalam reflektan ng
1 –5
0,5 –1
0,5 limit deteksi dalam fluoresens pg
50 –100
5 –10
5
Tipe Fase Diam TLC
HPTLC
Gel Silika G dan H 73,3
73,5 Selulosa
5,2 3,1
Poliamida 1,8
1,4 Fase Terikat
5,5 22,0
Aluminium Oksida 2,6
kieselguhr 0,3
Gel 0,4
Gugus silanol tunggal Dua gugus
silanol
Tiga gugus silanol
2. Fase Gerak
Pelarut dalam kromatografi memiliki dua fungsi yaitu sebagai pembawa sampel dan untuk memfasilitasi suatu sistem pemisahan. Fase gerak akan mengaliri
fase diam dan memfasilitasi transpor sampel yang ditotolkan. Oleh karena itu, kekuatan pelarut mempengaruhi kemampuannya untuk membawa sampel melalui
sistem dan selektivitasnya dalam menentukan apakah pemisahan dapat dilakukan. Sebagai pembawa, sampel harus terlarut ke dalam fase gerak dan untuk terjadinya
pemisahan, sampel harus tertahan oleh fase diam. Pada keadaan elusi yang ideal, setiap perpindahan dari sampel tidak saling mempengaruhi dengan sampel lain
yang ditotolakan pada lempeng tersebut Bollinger, Brenner, Ganshirt, Mangold, Seiler, Stahl, Waldi, 1962; Spangernberg et al., 2011.
Untuk mendapatkan komposisi fase gerak yang optimal yang dapat memisahkan campuran, pemilihan pelarut dapat didasari atas beberapa alasan,
antara lain: a.
Komposisi pelarut harus dapat memisahkan analit sampai dengan nilai R
f
yang baik yang terlihat berdasarkan kekuatan pelarutnya. b.
Komposisi pelarut yang selektif yang terlihat dari resolusi dua campuran yang sama-sama dapat terpisah. Parameter selektivitas akan
mempengaruhi nilai resolusinya. c.
Difusi harus sekecil mungkin selama pemisahan dan waktu yang diperlukan untuk memisah juga harus sesingkat mungkin.
Spangernberg et al., 2011
Beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak: a.
Fase gerak harus memiliki kemurnian yang sangat tinggi karena KLT adalah metode yang sangat sensitif.
b. Daya elusi fase gerak harus diatur untuk membentuk R
f
yang berkisar antara 0,2-0,8 agar pemisahannya maksimal.
c. Untuk pemisahan dengan fase diam polar seperti silika gel, polaritas
larutan akan mempengaruhi kecepatan migrasi sampel yang berarti juga menentukan nilai R
f
. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen
akan meningkatkan nili R
f
secara signifikan. d.
Sampel-sampel ionik dan sampel-sampel polar lebih baik menggunakan campuran pelarut sebagai fase geraknya, seperti
campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu. Gandjar dan Rohman, 2007
G. Densitometri
