fungsi integritas membran sitoplasma dirusak, makromolekul dan ion keluar dari sel yang menyebabkan kerusakan pada sel. Membran sel pada fungi dan bakteri mempunyai
struktrur yang berbeda, membran sel pada fungi mengandung sterol sedangkan bakteri tidak. Jadi antimikroba yang dapat berikatan dengan sterol yang akan mampu merusak
membran sel fungi Jawetz et al., 2005. Berdasarkan hal tersebut dapat diketahui bahwa kedelapan isolat BAL yang diujikan tidak mampu menghambat C. albicans yang dapat
disebabkan oleh tidak adanya senyawa-senyawa metabolit yang dihasilkan oleh isolat- isolat tersebut yang dapat berikatan dengan komponen penyusun dinding maupun
membran sel fungi tersebut.
Penelitian yang dilakukan oleh Kariptas et al., 2010 dan Lertcanawanichakul 2005 juga menunjukkan rendahnya aktivitas antifungal dari BAL terhadap C. albicans,
bahkan tidak ada sama sekali. Hal tersebut diduga karena C. albicans yang diisolasi dari manusia lebih resisten terhadap zat antimikroba karena pemakaian obat antifungal.
4.4 Karakterisasi Morfologi, Biokimia dan Fisiologi Sel Isolat Terpilih
Isolat-isolat yang menunjukkan zona penghambatan terhadap bakteri patogen kemudian dikarakterisasi lebih lanjut untuk mengetahui sifat morfologi, biokimia dan fisiologi
selnya. Ada 5 isolat yang telah diamati yaitu NQ1, NQ2, NQ3, NQ4, dan NQ5. Pemeriksaan diawali dengan pewarnaan Gram yang selanjutnya diamati di bawah
mikroskop cahaya pembesaran 1000x. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa kelima isolat tersebut berbentuk basil Gram positif Gambar 4.4.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 4.4 Pewarnaan Gram isolat BAL terpilih
Pewarnaan Gram dilakukan terhadap isolat yang berumur 20 jam. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa kelima isolat tersebut berbentuk basil, namun dapat
dilihat masing-masing isolat mempunyai perbedaan dari segi ukuran dan penataan selnya. Isolat NQ1 merupakan basil pendek kokobasil yang tidak berpasangan atau
membentuk rantai, basil ini dikenal dengan monobasil, sedangkan isolat NQ2 terlihat berpasangan dan ukurannya lebih besar daripada isolat NQ1. Isolat NQ3 terlihat lebih
panjang dan ramping juga ada yang terlihat berpasangan diplobasil, sedangkan isolat NQ4 merupakan basil pendek yang menyerupai rantai streptobasil. Isolat NQ5 terlihat
bergerombol dan ada yang membentuk rantai. Menurut Waluyo 2010, pewarnaan Gram merupakan slah satu prosedur yang
penting dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan Gram merupakan tahapan yang penting dalam identifikasi bakteri dan termasuk ke
NQ1 NQ2
NQ3
NQ4 NQ5
Universitas Sumatera Utara
dalam pewarnaan diferensial. Prescott, 2002 menambahkan bahwa, pewarnaan Gram dapat membedakan bakteri menjadi 2 kelompok yaitu bakteri Gram positif dan Gram
negatif. Perbedaan hasil dalam pewarnaan ini disebabkan perbedaan struktur, terutama komponen penyusun dinding sel kedua kelompok bakteri tersebut. Bakteri Gram positif
berwarna ungu yang disebabkan kompleks warna kristal violet-iodium tetap dipertahankan meskipun diberi larutan pemucat, sedangkan bakteri Gram negatif
berwarna merah karena kompleks warna tersebut larut sewaktu pencucian dengan aseton alkohol dan kemudian menyerap zat warna kedua yang berwarna merah.
Kriteria selanjutnya ialah pewarnaan spora. Hasil pengamatan menunjukkan kelima isolat membentuk spora dengan letak yang bervariasi, diantaranya yaitu oval
subterminal dan oval sentral atau oval memanjang Gambar 4.5. Menurut Lay 1994 dan Waluyo 2005, spora mempunyai bentuk yang beragam, ada yang bulat dan ada
juga yang bulat memanjang bergantung pada spesiesnya. Spora pada bakteri merupakan struktur yang tahan panas dan bahan kimia. Spora dibentuk oleh bakteri tertentu untuk
mengatasi lingkungan yang kurang menguntungkan. Spora terbentuk di dalam sel bakteri sehingga sering disebut sebagai endospora dan hanya terdapat 1 spora saja.
Endospora ada yang lebih kecil dan ada juga yang lebih besar daripada diameter sel induknya. Lapisan luar spora merupakan penahan yang baik terhadap bahan kimia,
sehingga spora sulit diwarnai. Oleh sebab itu sel bakteri harus dipanaskan, karena pemanasan menyebabkan lapisan luar spora mengembang dan menyebabkan zat warna
masuk.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 4.5 Pewarnaan spora isolat BAL terpilih
Isolat-isolat tersebut selanjutnya diuji aktivitas katalasenya dengan meneteskan larutan H
2
O
2
3 pada masing-masing isolat. Hasil pengamatan menunjukkan hasil positif dengan terbentuknya gelembung udara. Lay 1994 menyatakan bahwa, katalase
merupakan suatu enzim yang mengkatalisasikan penguraian hidrogen peroksida menjadi air dan O
2
. Hidrogen peroksida bersifat toksik terhadap sel karena bahan ini menginaktivasikan enzim dalam sel. Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme
aerob, sehingga mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan aerob harus menguraikan bahan toksik tersebut.
NQ1 NQ2
NQ3
NQ4 NQ5
Universitas Sumatera Utara
Kriteria yang diamati selanjutnya ialah motilitas dan reaksi pada media TSIA. Hasil menunjukkan bahwa kelima isolat bersifat motil, hal ini ditunjukkan adanya
pertumbuhan di sekitar tusukan ose dan permukaan media SIM. Reaksi yang terlihat pada media TSIA ialah bagian butt berwarna kuning dan bagian slant berwarna merah,
tidak adanya terbentuk gas maupun H
2
S. Hal ini mengindikasikan bahwa hanya glukosa yang dapat difermentasikan oleh kelima isolat tersebu dan tidak memfermentasikan
laktosa maupun sukrosa. Menurut Lay 1994, komposisi media TSIA diantaranya ialah 3 jenis gula yang berbeda yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa. Bila slant berwarna merah
berarti bersifat basa dan butt berwarna kuning berarti bersifat asam. Selain itu hasil uji terhadap kelima isolat menunjukkan bahwa pada medium TSIA tidak terbentuk endapan
berwarna hitam di bagian bawah tabung. Hal ini berarti, semua isolat bakteri tersebut tidak mempunyai enzim desulfurase yang berfungsi untuk memecah sistin dan tidak
menghasilkan H
2
S, sehingga dapat disimpulkan bahwa bakteri yang terdapat pada produk pliek u tidak mampu menggunakan asam amino sistin sebagai sumber energinya.
Kemampuan 5 isolat terpilih menghasilkan asam yang diduga asam laktat dengan memfermentasikan glukosa menunjukkan bahwa bakteri-bakteri yang diisolasi
dari pliek u tergolong ke dalam BAL homofermentatif. Hal ini ditunjukkan dengan tidak adanya pembentukan gas CO
2
pada tabung Durham dari fermentasi glukosa pada pengujian produksi gas dari glukosa. Wirawati 2002; Yavuzdurmaz 2007; Jay et al.
2005 menyatakan bahwa, BAL dibagi menjadi dua grup berdasarkan hasil akhir metabolisme glukosa. BAL yang hanya menghasilkan asam laktat pada fermentasi
glukosa termasuk dalam golongan homofermentatif. BAL yang menghasilkan asam laktat, CO
2
dan etanol dari heksosa termasuk dalam golongan heterofermentatif. BAL yang tergolong homofermentatif dapat mengubah 95 glukosa atau heksosa lainnya
menjadi asam laktat. Karbondioksida dan asam-asam volatil lainnya juga dihasilkan, namun dalam jumlah yang sangat kecil.
Universitas Sumatera Utara
Pengujian pertumbuhan 5 isolat BAL terpilih pada suhu dan toleransi pada pH, serta MRSA + konsentrasi NaCl yang berbeda telah dilakukan. Pengamatan dilakukan
selama 3 hari. Hasil pengamatan menunjukkan kelima isolat mampu tumbuh pada suhu 30, 40 dan 50°C, namun tidak mampu tumbuh pada suhu 10°C. Selain itu kelima isolat
juga mampu bertahan pada kisaran pH 3,5 sampai 8 dan memiliki toleransi terhadap NaCl 2 sampai 10. Kriteria pendukung lainnya ialah kelima isolat mempunyai
aktivitas amilolitik, proteolitik, dan kitinolitik yang ditandai dengan terbentuknya zona bening pada permukaan medium SA, susu skim dan MGMK. Keseluruhan data
karaktersitik kelima isolat dapat dilihat pada Tabel 4.2.
Berdasarkan pengamatan sifat morfologi, biokimia, dan fisiologinya serta uraian di atas dapat diketahui bahwa BAL yang sudah diisolasi dari sampel pliek u bukan
merupakan kelompok BAL pada umumnya. Hal ini dapat dilihat dari adanya perbedaan maupun kesamaan karakteristik antara BAL yang sudah diisolasi dari pliek u dengan
BAL yang pernah diteliti sebelumnya. Kelima isolat yang diperoleh dari pliek u, selnya berbentuk basil Gram positif dengan katalase positif, bersifat motil, dan membentuk
endospora. Berdasarkan ciri dan karaktersitik yang telah diamati kelima isolat tersebut termasuk ke dalam genus Bacillus.
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.2 Karakteristik morfologi dan fisiologi sel isolat terpilih
Karakteristik Isolat
NQ1 NQ2
NQ3 NQ4
NQ5
Sifat morfologi sel
Bentuk Basil
Basil Basil
Basil Basil
Gram +
+ +
+ +
Endospora +
+ +
+ +
Sifat biokimia dan fisiologi sel
Katalase +
+ +
+ +
Motilitas TSIA :
Slant Butt
Gas H
2
S Pembentukan asam
Tipe Fermentasi Fermentasi Karbohidrat
+ M
K -
- +
Homofer Glu
+ M
K -
- +
Homofer Glu
+ M
K -
- +
Homofer Glu
+ M
K -
- +
Homofer Glu
+ M
K -
- +
Homofer Glu
Pertumbuhan pada suhu :
10°C 30°C
45°C 50C
- +
+ +
- +
+ +
- +
+ +
- +
+ +
- +
+ +
Pertumbuhan pada MRSA + NaCl :
2 4
6 6,5
8 10
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
Pertumbuhan pada pH :
3,5 4
4,5 5
5,5 6
6,5 7
7,5 8
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
Produksi Enzim :
Amilase Protease
Kitinase +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
Keterangan: M : merah, K : kuning, Homofer : homofermentatif, Glu : glukosa
Universitas Sumatera Utara
Berdasarkan profile matching menggunakan buku identifikasi Bergey’s Manual
Systematic Bacteriology, kelima isolat memiliki kemiripan ciri dan karaktersitik dengan bakteri-bakteri yang tergolong ke dalam genus Bacillus. Diantaranya ialah morfologi sel
yang berbentuk batang, lurus atau bengkok dengan penataan sel tunggal atau berpasangan, ada juga yang membentuk rantai dan terkadang membentuk filamen yang
panjang. Terbentuknya endospora berjumlah 1 pada tiap selnya. Bersifat motil dengan flagel tipe peritrikus, aerob atau fakultatif anaerob, katalase positif, dan toleran terhadap
kadar garam yang tinggi. Bakteri-bakteri dari genus ini sering diisolasi dari tanah atau lingkungan yang mempunyai kontak langsung maupun tidak langsung dengan tanah.
Bakteri ini juga ditemukan di air dan makanan. Selain itu karakteristik fenotip dari kelima isolat juga memiliki kemiripan dengan bakteri-bakteri yang termasuk genus
Sporolactobacillus, bakteri dari kelompok ini juga merupakan bakteri basil Gram positif motil yang menghasilkan asam laktat dari fermentasi glukosa, namun aktivitas
katalasenya negatif. Perbedaan dan persamaan tersebut terangkum pda Tabel 4.3.
Tabel 4.3 Perbedaan dan persamaan karakteristik utama antara genus Bacillus, Lactobacillus, dan Sporolactobacillus dengan kelima isolat yang diisolasi dari
pliek u
Properti Genus
Bacillus Lactobacillus
Sporolactobacillus Isolat
NQ1 NQ2
NQ3 NQ4
NQ5
Bentuk sel
Basil Basil
Basil Basil
Basil Basil
Basil Basil
Pewarnaan Gram +
+ +
+ +
+ +
+
Pewarnaan spora +
- +
+ +
+ +
+
Katalase +
- -
+ +
+ +
+
Produksi asam laktat +-
+ +
+ +
+ +
+
Motilitas
+ -
+ +
+ +
+ +
Keterangan: +-: beberapa spesies Bacillus mampu memproduksi asam laktat seperti B. coagulans
Lima isolat yang diperoleh diisolasi pada media MRSA. MRSA merupakan medium selektif, berdasarkan formula yang dikembangkan oleh de Man, Rogosa dan
Sharpe untuk mendukung pertumbuhan bakteri yang umumnya tergolong genus Lactobacillus. Man et al. 1960 menyatakan bahwa, medium ini merupakan medium
yang baik untuk pertumbuhan bakteri-bakteri asam laktat seperti Lactobacillus,
Universitas Sumatera Utara
Pediococcus, dan Leuconostoc. Komposisi medium MRSA terdiri dari Glucose, Bacteriological peptone, beef extract, sodium acetate, yeast extract, ammonium citrate,
tween 80, magnesium sulfate, manganese sulfate, bacteriological agar. Amonium sitrat yang terkandung dalam media ini, pada pH rendah akan menghambat mikroorganisme
lain yang tidak diinginkan. Dipotasium fosfat dan sodium asetat digunakan sebagai bufer dalam media ini untuk mengatur pH rendah. Atlas 2010 menambahkan, MRSA
biasanya digunakan untuk isolasi dan kultivasi BAL. Bayane et al. 2010 telah berhasil mengisolasi 5 bakteri berspora penghasil
asam laktat yang berasal dari sampel tanah. Semua isolat yang ditemukannya memiliki ciri-ciri Gram positif basil, motil, mesofilik, fakultatif anaerob, katalase positif dan
menghasilkan asam laktat. Isolat-isolat tersebut telah dikarakterisasi dan diidentifikasi dengan metode polifasik. Metode polifasik merupakan metode yang sangat tepat dan
akurat untuk melakukan klasifikasi dan identifikasi prokariot. Metode polifasik ini merupakan gabungan karakterisasi secara fenotip dan genotip. Analisis sekuen 16S-
rDNA terhadap kelima isolat tersebut menunjukkan bahwa 2 isolat termasuk genus Bacillus dan ketiga isolat lainnya termasuk genus Paenibacillus. Analisis biokimia dan
fisiologi menunjukkan bahwa isolat-isolat tersebut sedikit berbeda dari BAL berspora pada umumnya. Isolat-isolat tersebut resisten terhadap garam empedu dan kondisi asam,
selain itu juga dapat memproduksi enzim amilolitik dan proteolitik yang menjadikannya sebagai kandidat yang sesuai untuk diaplikasikan di bidang teknologi tertentu, terutama
dalam fermentasi makanan dan sebagai formulasi untuk probiotik. Penelitian tersebut menunjukkan diversitas yang penting mengenai jenis-jenis BAL yang berspora dan
menegaskan karya-karya sebelumnya serta membuktikan bahwa SFLAB spore forming lactic acid bacteria merupakan kandidat yang baik untuk diaplikasikan sebagai
formulasi probiotik dan teknologi fermentasi pangan. Salah satu spesies yang dikenal sebagai BAL berspora penghasil asam laktat
ialah Bacillus coagulans. Bakteri ini tergolong bakteri probiotik Hyronimus et al.,
Universitas Sumatera Utara
2000; Sudha et al., 2010. B. coagulans merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu basil Gram positif, katalase positif, dan motil. B. coagulans juga dikenal dengan nama
Lactobacillus sporogenes karena adanya kemiripan beberapa sifat morfologi dan sifat fisiologi dengan bakteri dari genus Lactobacillus. L. sporogenes pertama sekali diisolasi
dan dideskripsikan pada tahun 1933 dan dimasukkan ke dalam Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology pada edisi ke 5. Namun nama bakteri ini diubah menjadi B. coagulans di edisi ke 7 pada buku tersebut. Hal ini disebabkan adanya penyederhanaan
katalog. Namun nama L. sporogenes masih digunakan secara luas untuk menghormati penemunya, meskipun untuk keperluan taksonomi tidak digunakan. Hasil riset
menunjukkan bahwa L. sporogenes lebih dekat kekerabatnnya dengan genus Lactobacillus daripada genus Bacillus, walaupun penempatannya dalam taksonomi
termasuk ke dalam genus Bacillus Ara et al., 2002; Vacchi dan Drago, 2006; Ozusaglam dan Ozcan, 2009; Vos et al.,2009.
4.5 Populasi BAL dan Non BAL dari Sampel Pliek U
