acetate buffer pH 3.5, pH 4, pH 4.5, pH 5, pH 5,5, dan phosphate buffer pH 6, pH 6.5, pH 7, pH 7.5, dan pH 8. Pembuatan buffer dapat dilihat pada Lampiran D.
Alat-alat yang digunakan terdiri dari jarum ose, labu erlenmeyer, silinder ukur, gelas kimia, cawan petri, tabung reaksi, rak tabung, pipet serologi ukuran 0.1 ml, 1 ml,
dan 10 ml, propipet, corong, kaca benda, bunsen, autoklaf STURDY SA-300VF, blank disc OXOID, mikroskop OLYMPUS, timbangan digital OHAUS, lemari
pendingin DENPOO, oven MEMMERT, BR-2000 vortexer BIO-RAD, hot plate stirrer LabTech, inkubator LabTech dan Laminar Air Flow ESCO, cary 50 uv-
visible spectrophotometer VARIAN Inc., mechanical hand counter, dan sentrifus SORVALL Biofuge Primo R.
3.3 Metode Penelitian
Penelitian ini terbagi menjadi 7 tahapan, yaitu : 1 Pengukuran total asam pada sampel pliek u tahap pemerosesan I, II, dan III, 2 Penghitungan populasi BAL dan non-BAL
3 Isolasi BAL dari pliek u tahap I, II, dan III 4 Uji antagonis BAL terhadap mikroorganisme patogen 5 Karakterisasi isolat bakteri potensial berdasarkan sifat
morfologis, fisiologis dan biokimia 6 Identifikasi BAL sampai tingkat genus menggunakan
Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology 7 Uji kualitatif enzim protease, amilase, dan kitinase. Diagram alir prosedur kerja dapat dilihat pada lampiran
B.
3.3.1 Pengukuran Total Asam yang Diduga Asam Laktat
Pengukuran total asam dilakukan dengan metode Association of Official Analytical Chemists A.O.A.C Akmar, 2006; Candra, 2006. Sebanyak 10 g sampel pliek u tahap
I, II dan III dihancurkan dengan menggunakan mortar. Sampel yang telah homogen dilarutkan dengan akuades dalam gelas piala sampai tanda tera 100 ml. Setelah itu
Universitas Sumatera Utara
sampel didiamkan selama 30 menit dan diaduk. Larutan yang berisi sampel tersebut disaring dan dipipet sebanyak 10 ml yang kemudian dimasukkan ke dalam beaker glass.
Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 2-3 tetes fenolftalein dan dititrasi dengan NaOH 0,1 N sampai warna berubah menjadi merah muda. Konsentrasi total asam tertitrasi
dihitung sebagai persen asam laktat yang dihitung berdasarkan rumus:
Total Asam = V NaOH x N NaOH x 90 x FP x 100 Bobot sampel x 1000
Keterangan : V NaOH
= Volume NaOH yang terpakai N NaOH
= Normalitas NaOH 0,1 N 90
= Berat molekul asam laktat FP
= Faktor Pengenceran 10 Bobot sampel = 10 g
3.3.2 Penghitungan Populasi BAL dan Non BAL
Penghitungan jumlah BAL dan non BAL dilakukan dengan metode cawan sebar Lay,1994; Cappucino dan Sherman, 1999 dengan modifikasi. Dibuat pengenceran 10
-1
sampai dengan 10
-7
untuk sampel pliek u tahap III. Sebanyak 0.1 ml dari pengenceran 10
-3
sampai 10
-7
disebar ke dalam cawan petri, untuk BAL ditumbuhkan pada media MRSA dan untuk non BAL pada media PCA yang diinkubasi selama 48 jam pada suhu
37°C. Dihitung koloni pada cawan yang mempunyai 30-300 koloni dengan menggunakan mechanical hand counter. Setelah itu dihitung jumlah sel mikroorganisme
hidup dengan mengalikan faktor pengenceran dengan jumlah koloni yang dinyatakan dengan CFUml.
Universitas Sumatera Utara
3.3.3 Isolasi BAL
Isolasi BAL dilakukan dengan metode cawan sebar, yaitu dengan mensuspensikan 1 g pliek u ke dalam 9 ml NaCl fisiologis 0.85 secara aseptis, kemudian pengenceran 10
-4
-
10
-7
, diambil 0.1ml dan disebar ke cawan petri steril yang berisi media MRSA dengan dua kali ulangan. Setelah itu diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37° C dan diamati
pertumbuhan koloninya Cappuccino dan Sherman, 1999 . Koloni yang terpisah dengan bentuk dan ukuran yang berbeda diambil
menggunakan jarum ose steril dan digoreskan pada MRSA padat dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 2 hari. Penggoresan dilakukan sampai diperoleh koloni yang
seragam. Koloni yang telah murni dipilih berdasarkan sifat morfologi koloninya sebagai karakterisasi awal. Selanjutnya kultur dipindahkan ke dalam 1 tabung NB yang
mengandung 0.2 agar dan CaCO
3
untuk digunakan sebagai kultur stok, sedangkan kultur kerja dibuat dalam agar miring yang disimpan dalam lemari es. Kultur stok
diperbaharui setiap 3 bulan sekali.
3.3.4 Uji Antagonis BAL Terhadap Mikroorganisme Patogen
