Pengaruh pH: sebanyak 1 ml kultur ditumbuhkan pada medium NB dengan penambahan acetate buffer pH 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, dan phosphate buffer pH 6, 6.5, 7, 7.5,
8, diinkubasi pada suhu 37°C selama 3 hari. Adanya pertumbuhan ditandai dengan kekeruhan pada tabung dan diukur optical density OD pada
600
dengan spektrofotometer Lay, 1994; Wirawati, 2002; Santoso, 2008 dengan modifikasi.
3.4.7 Pengaruh NaCl terhadap Pertumbuhan Isolat Terpilih
Toleransi isolat terpilih terhadap NaCl dilakukan dengan menotolkan isolat yang diperoleh pada media MRSA yang sudah ditambahkan NaCl dengan konsentrasi yang
berbeda yaitu 2, 4, 6, 6,5, 8, dan 10. Setelah itu diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam dan diamati pertumbuhannya dengan mengamati besar kecilnya koloni
Bulut, 2003; Yavuzdurmaz, 2007.
3.4.8 Uji Produksi Gas dari Glukosa
Pengujian ini dilakukan untuk membedakan antara BAL homofermentatif dan BAL heterofermentatif. Sebanyak 1 ml kultur BAL yang berumur 24 jam dipipetkan ke
dalam tabung reaksi berisi tabung Durham dan media NB yang ditambahkan 2 glukosa. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C selama 5 hari. Tabung Durham
digunakan untuk melihat terbentuknya gas atau tidak. Tabung yang menghasilkan gas menunjukkan adanya produksi gas dari glukosa yang menandakan isolat tersebut bersifat
heterofermentatif, tabung yang tidak terbentuk gas menandakan isolat bersifat homofermentatif Bulut, 2003; Yavuzdurmaz, 2007.
3.5 Identifikasi Isolat yang Diduga BAL Sampai Tingkat Genus
Data yang telah diperoleh dari hasil pengujian karakterisasi, isolat bakteri selanjutnya diidentifikasi dengan menduga jenis BAL yang telah diisolasi dari pliek u.
Universitas Sumatera Utara
Pendugaan jenis bakteri dilakukan dengan menggunakan metode profile matching berdasarkan
Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Vos, 2009 dan Helen, 2012.
3.6 Uji Kualitatif Aktivitas Protease, Amilase dan Kitinase
Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas proteolitik, amilolitik, dan kitinolitik dari isolat yang diperoleh. Analisis hidrolisis protein, amilum, dan kitin
dilakukan dengan menumbuhkan isolat yang diperoleh pada medium susu skim Lay, 1994; Smita et al., 2012, SA Putri et al. 2012, dan MGMK Dewi, 2008. Selanjutnya
diinkubasi selama 72 jam pada suhu 37°C. Isolat-isolat yang menghasilkan protease, amilase dan kitinase akan menunjukkan zona bening pada masing-masing permukaan
media. Diameter zona bening yang terbentuk diukur untuk melihat besarnya aktivitas enzim tersebut secara kualitatif.
3.7 Pengukuran Total Asam Supernatan Isolat BAL Terpilih
Isolat yang telah disegarkan pada media MRSA kemudian diambil satu ose dan dimasukkan ke dalam media NB sebagai inokulum. Inokulum diinkubasi pada
suhu 37°C pada shaker water bath selama 18 jam. Sebanyak 10 inokulum dimasukkan ke dalam media produksi dengan volume kerja 100 ml, kemudian
diinkubasi dalam shaker water bath pada suhu 37° C selama 24 jam. Pemanenan supernatan dilakukan dengan cara sentrifugasi media kultivasi pada suhu 4° C
dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan dipisah dari biomassa untuk diukur total asam yang dinyatakan sebagai persen asam laktat AOAC, 1995;
Purnama, 2009; Mardiana, 2010; Nielsen, 2010; Omemu et al., 2011; Saputra, 2011 dengan Modifikasi.
Pengukuran total asam tertitrasi merupakan penentuan konsentrasi total asam. Pada supernatan, asam tertitrasi dihitung sebagai persen asam laktat. Pengukuran
asam tertitrasi menggunakan prinsip asam basa. Sebanyak 10 ml sampel dimasukkan
Universitas Sumatera Utara
ke dalam labu erlenmeyer, kemudian ditambahkan 3 tetes indikator phenolphtalein 1. Sampel dititrasi dengan larutan NaOH 0.1 N sampai terbentuk warna merah muda yang
merupakan titik akhir titrasi. Volume titran yang digunakan, normalitas basa standar, volume contoh digunakan untuk menghitung total asam tertitrasi. Perhitungan total
asam tertitrasi dapat dihitung dengan menggunakan rumus :
Total Asam = V NaOH x N NaOH x 90 x FP x 100 V sampel x 1000
Keterangan : V NaOH
= Volume NaOH yang terpakai ml N NaOH
= Normalitas NaOH 0,1 N 90
= Berat molekul asam laktat FP
= Faktor pengenceran V Sampel
= Volume sampel yang digunakan ml
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Persentase Total Asam pada Bahan Pangan
Pliek U
Sebelum dilakukan tahapan isolasi, setiap sampel pliek u tahap I, II, dan III diukur total asam yang diduga sebagai asam laktat. Dari hasil pengukuran diketahui bahwa setiap
tahapan dari proses pembuatan pliek u menghasilkan persentase total asam yang berbeda. Berdasarkan Gambar 4.1 dapat dilihat kadar asam tertinggi berasal dari pliek u
tahap III yaitu sebesar 4,92, sedangkan yang terendah ialah pada pliek u tahap I yaitu sebesar 1,07. Hal ini dapat dihubungkan dengan adanya perbedaan jenis dan jumlah
BAL yang ditemukan di setiap tahapan pengolahan pliek u, sehingga kadar asam yang dihasilkan juga bervariasi.
1 2
3 4
5 6
To ta
l asam
PT1 PT2
PT3
Gambar 4.1 Persentase total asam pada tiga tahapan pengolahan pliek u PT1: pliek u tahap I, PT2: pliek u tahap II, PT3: pliek u tahap III
Universitas Sumatera Utara
Telah diketahui bahwa pliek u diolah dari daging buah kelapa C. nucifera yang terfermentasi secara spontan, dan daging kelapa tersebut tersusun oleh berbagai jenis
komponen, salah satunya ialah karbohidrat. Sumber karbohidrat tersebut akan diuraikan oleh BAL menjadi senyawa-senyawa lain menjadi produk yang berbeda dari bahan
bakunya. Menurut Fardiaz 1992, karbohidrat merupakan substrat utama yang dipecah dalam proses fermentasi. Polisakarida terlebih dahulu akan diurai menjadi gula
sederhana sebelum difermentasi, sebagai contoh hidrolisis pati menjadi unit-unit glukosa. Glukosa selanjutnya akan diurai menjadi senyawa-senyawa lain. Pada BAL,
asam piruvat yang yang terbentuk dari jalur glikolisis bertindak sebagai penerima hidrogen, dimana reduksi asam piruvat oleh NADH
2
menghasilkan asam laktat. Fermentasi ini disebut fermentasi homolaktat, karena satu-satunya produk yang
dihasilkan ialah asam laktat dan BAL yang berperan dalam fermentasi tipe ini dikenal dengan BAL homofermentatif.
4.2 Isolasi BAL dari
Pliek U
Sebanyak 8 isolat yang diduga BAL telah diisolasi dari sampel pliek u tahap I, II, dan III. Kedelapan isolat yang berbeda tersebut yaitu NSP1, MY2, MY3, NQ2, NQ3, NQ4,
NQ5, dan NQ6, masing-masing isolat mempunyai profil yang beragam. Berdasarkan hasil pengamatan terhadap sifat morfologi koloni dapat diketahui bahwa dari sampel
pliek u tahap I, dimulai dari pemupukan ke media MRSA yang berasal dari pengenceran 10
-3
sampai dengan pengenceran 10
-7
keseluruhannya hanya ditumbuhi oleh isolat NSP1. Isolat tersebut memiliki ciri-ciri koloni berbentuk bulat, berwarna putih susu dengan tepi
halus dan elevasi konveks. Pada pliek u tahap II, ditemukan 3 koloni yang berbeda yaitu MY1, MY2, dan
MY3. MY1 mempunyai ciri-ciri morfologis yang sama dengan NSP1, sedangkan MY2 dan MY3 berbeda. Pada pliek u tahap III, diperoleh 6 koloni yang berbeda yaitu NQ1,
NQ2, NQ3, NQ4, NQ5, dan NQ6. Pada tahap ini ditemukan satu koloni yang sama dengan MY2 yaitu NQ1. Adanya koloni yang berbeda ini diduga karena proses
Universitas Sumatera Utara
pengolahan daging buah kelapa menjadi pliek u yang berbeda di setiap tahapnya Lampiran A sehingga menyebabkan ditemukannya ciri-ciri koloni bakteri yang
berbeda. Keseluruhan sifat-sifat morfologis dari setiap isolat disajikan pada Tabel 4.1.
Tabel 4.1 Karakteristik morfologi koloni bakteri yang diduga BAL Tahapan
Pengolahan Pliek u
Kode Isolat
Sifat Morfologi Koloni Bentuk
Warna Tepi
Elevasi Keterangan
I NSP1
bulat putih
susu halus
konveks -
II NSP1
bulat putih
susu halus
konveks isolat sama
dengan NSP1
MY2 tidak
beraturan Krem
lobat umbonat
- MY3
tidak beraturan
Krem bergelombang
datar -
III NQ1
tidak beraturan
Krem lobat
umbonat isolat sama
dengan MY2
NQ2 tidak
beraturan Krem
bergelombang umbonat
- NQ3
tidak beraturan
krem bergelombang datar
- NQ4
tidak beraturan
Krem bergelombang
tumbuh ke dalam
media -
NQ5 tidak
beraturan Krem
lobat datar
- NQ6
tidak beraturan
Krem filamen
umbonat -
Menurut Wirawati 2002, pada fermentasi bahan pangan tradisional yang berlangsung secara spontan, mikroorganisme yang secara alami ada di dalam bahan
pangan akan tumbuh dan mengakibatkan suksesi atau pergantian mikroba yang
Universitas Sumatera Utara
dominan pada proses selanjutnya. Fardiaz 1992 juga menambahkan bahwa populasi mikroba yang ditemukan pada setiap makanan, bila diamati jumlah dan jenisnya, sangat
bervariasi. Hal ini disebabkan karena adanya pengaruh selektif terhadap jumlah dan jenis mikroba awal yang terdapat pada makanan. Sumber-sumber mikrobiota yang
terdapat pada makanan dapat berasal dari tanah, air permukaan, debu, kotoran hewan atau manusia, lingkungan, udara dan sebagainya. Berbagai pengaruh selektif
menyebabkan satu atau beberapa jenis mikroba mungkin menjadi dominan dibandingkan dengan jenis mikroba lainnya.
4.3 Seleksi Isolat Potensial Berdasarkan Uji In vitro
