Bahan dan Alat Penelitian Pendahuluan

3 METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Laboratorium Produktivitas Lingkungan Manajemen Sumberdaya Perairan, Laboratorium Nutrisi Ikan Budidaya Perairan dan Laboratorium Lembaga Farmasi TNI Angkata Laut LAFIAL, Jakarta. Penelitian ini dilaksanakan selama bulan Maret hingga bulan Desember 2012.

3.2 Bahan dan Alat

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah Spirulina platensis bubuk komersial yang diperoleh dari Jepara- Jawa Tengah dan Spirulina plantensis yang dikultivasi di Balai Budidaya Air Payau BBAP Situbondo-Jawa Tengah. Bahan-bahan untuk media kultivasi meliputi klorin, tiosulfat, air tawar, air laut, MgSO 4 , K 2 SO 4, CaCl 2, CuSO 4, Na 2 HPO 4, NaHCO 3, urea, ZA, vitamin B 12, media Walne, akuades, asam sitrat dan alkohol 70. Bahan tambahan tablet meliputi talk dan mint, magnesium stearat, dan sorbitol diperoleh di toko kimia, avicel dan aerosil diperoleh dari Univesitas Pancasila. Bahan analisis meliputi DPPH, metanol, H 2 SO 4, NaOH 40, H 3 BO 3, HCl 0,1N. Alat yang digunakan meliputi peralatan kultivasi yaitu akuarium, toples, bak kultivasi, nylon mesh, selang, aerator, gelas ukur, corong, filter, pipet volumetrik, pengaduk kayu, kain lap atau tisu dan Water Quality Meter WQM. Alat pengujian meliputi mikropipet, labu takar, tabung reaksi, sudip, tissue, alumunium foil, gelas piala, timbangan digital, spektrofotometri, tabung kjeltab, desikator, cawan porselen, oven, tanur, erlenmeyer, gelas arloji, pengempa tablet, friabilitimeter, dan hardness terster.

3.3 Metode Penelitian

Penelitian ini terdiri dari dua tahap yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian pendahuluan yaitu penentuan jenis bahan pengikat tablet menggunakan Spirulina komersial. Penelitian utama terdiri dari formulasi tablet hisap menggunakan Spirulina komersial, penentuan formula terbaik berdasarkan uji fisik dan uji hedonik, kultivasi Spirulina, analisis bahan baku Spirulina, pembuatan tablet hisap Spirulina hasil kultivasi dan analisis komposisi kimia tablet hisap Spirulina. Pengujian yang dilakukan meliputi pengujian fisik, pengujian organoleptik, pengujian proksimat, pengujian antioksidan, dan penentuan nilai AKG.

3.3.1 Penelitian pendahuluan

Penelitian pendahuluan dilakukan untuk mencari jenis bahan pengikat yang baik dalam pembuatan tablet hisap. Penentuan jenis bahan pengikat tablet dilakukan dengan trial and error menggunakan tiga jenis bahan pengikat yang berbeda yaitu hydroxypropyl methylcellulose HPMC, avicel dan gum arab dengan menggunakan metode kempa langsung.

3.3.2 Penelitian utama

Penelitian utama terdiri dari beberapa tahap yaitu formulasi tablet hisap Spirulina platensis, pemilihan formula terbaik, pembuatan tablet hisap Spirulina hasil kultivasi dan analisis komposisi kimia tablet hisap Spirulina. 1 Formulasi tablet hisap Spirulina platensis Tahap formulasi menggunakan serbuk Spirulina komersial sebagai bahan bakunya. Bahan-bahan yang digunakan terdiri dari bahan aktif utama yaitu serbuk Spirulina platensis komersial, bahan pengisi seperti sorbitol dan avicel, bahan pelincir seperti Mg stearat, aerosil, dan talk serta bahan pemberi cita rasa mint. Bahan-bahan tersebut terbagi menjadi dua fase yaitu fase dalam dan fase luar. Fase dalam merupakan bahan-bahan yang mempunyai komposisi besar atau utama dalam tablet, sedangkan fase luar merupakan bahan tambahan dalam jumlah kecil. Formulasi tablet hisap terdiri dari empat jenis formula dengan perbedaan konsentrasi Spirulina dan konsentrasi mint. Sorbitol merupakan bahan terakhir yang ditambahkan untuk memperoleh jumlah total 100 sehingga jumlah sorbitol tidak sama pada setiap formula. 2 Pemilihan formula terbaik Pemilihan formula terbaik dilakukan berdasarkan uji karakteristik fisik tablet dan uji hedonik tablet hisap Spirulina. Uji karakteristik fisik tablet hisap Spirulina terdiri dari beberapa uji yaitu keseragaman bobot, kekerasan tablet dan keregesan tablet, sedangkan uji hedonik tablet dilakukan dengan pengujian terhadap 30 orang panelis pada parameter kenampakan, warna, rasa, aroma, dan tekstur tablet. 3 Kultivasi dan pemanenan Spirulina platensis Kultivasi Spirulina platensis bertujuan untuk memperoleh biomasa Spirulina yang digunakan sebagai bahan baku pada pembuatan tablet hisap. Tahapan pada kultivasi Spirulina platensis adalah persiapan alat, kultur bibit Spirulina menggunakan media Walne dengan penambahan bibit 10-15. Pemanenan bibit Spirulina dilakukan setelah 7 hari kemudian bibit dikultivasi di akuarium menggunakan media MT. Spirulina selanjutnya dikultivasi kembali ke dalam tandon menggunakan media MT. Pemanenan Spirulina pada tahap ini dilakukan setelah 22 hari dengan OD 0,5 fase stasioner. Spirulina disaring menggunakan plankton net ukuran 90 mesh sehingga diperoleh biomassa Spirulina dalam bobot basah. Selanjutnya Spirulina dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 40 ○ C selama 24-48 jam kemudian digerus hingga menjadi serbuk Spirulina sebagai bahan dasar pembuatan tablet hisap. Diagram alir proses kultivasi Spirulina platensis dapat dilihat pada Gambar 2. Gambar 2 Diagram alir kultivasi Spirulina platensis MT: Modifikasi Zarrouk, komunikasi pribadi Hastuti 2011. Kultivasi Spirulina dalam media MT-MT Kultivasi Spirulina dalam media Walne Kultivasi Spirulina dalam media Walne- MT Pemanenan Biomasa Spirulina Pengeringan Serbuk Spirulina Analisis komposisi kimia dan aktivitas antioksidan 4 Analisis bahan baku Analisis bahan baku bertujuan untuk mengetahui komposisi kimia, aktivitas antioksidan bahan baku Spirulina komersial dan Spirulina hasil kultivasi yang meliputi pengukuran kadar air, kadar abu, lemak, protein, dan karbohidrat. 5 Pembuatan tablet hisap Spirulina hasil kultivasi Setelah diperoleh serbuk Spirulina hasil kultivasi langkah selanjutnya adalah mengaplikasikan serbuk Spirulina tersebut dalam pembuatan tablet dengan formula terpilih. Metode yang digunakan dalam pembuatan tablet hisap Spirulina adalah metode kempa langsung dengan tahapan sebagai berikut: penimbahan bahan, pengayakan, pencampuran, dan pengempaan. Bahan yang digunakan terdiri dari bahan aktif yaitu serbuk Spirulina platensis hasil kultivasi, bahan pengisi sorbitol, dan avicel, bahan pelincir Mg stearat, aerosil, dan talk, dan pemberi cita rasa mint. Diagram alir proses pembuatan tablet hisap Spirulina dapat dilihat pada Gambar 3. Gambar 3 Digram alir Proses pembuatan tablet hisap Spirulina platensis Lachman 1994. Tablet hisap Spirulina Pengocokan Pengempaan tablet metode kempa langsung Penimbangan bahan-bahan Pencampuran dalam kantung plastik Serbuk Spirulina dan bahan-bahan tambahan tambahan Analisis komposisi kimia dan aktivitas antioksidan

3.4 Prosedur Analisis

Analisis yang dilakukan pada serbuk Spirulina adalah analisis proksimat sedangkan analisis yang dilakukan untuk mendapatkan tablet formulasi terbaik yaitu uji karakteristik fisik tablet hisap Spirulina meliputi: keseragaman bobot, kekerasan, keregesan, dan organoleptik. Tablet Spirulina terpilih akan dilakukan analisis meliputi: kadar lemak, kadar air, kadar abu, kadar protein, antioksidan dan penentuan nilai AKG.

3.4.1 Keseragaman bobot Departemen Kesehatan RI 1995

Keseragaman bobot diukur dengan menimbang 20 tablet secara satu persatu. Kemudian setiap tablet dihitung bobot rata-ratanya. Berdasarkan Departemen Kesehatan RI syarat keseragaman bobot tablet yaitu tidak lebih dari 2 tablet yang masing-masing bobotnya menyimpang dari kolom A dan tidak ada satu tablet yang bobotnya menyimpang dari kolom B. Batas penyimpangan bobot rata-rata tablet dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3 Batas penyimpangan bobot rata-rata tablet. Bobot rata-rata Penyimpangan bobot rata-rata A B 25 mg atau kurang 15 30 26 mg sampai 150 mg 10 20 151 mg sampai 300 mg 7,5 15 Lebih dari 300 mg 5 10 Sumber: Departemen Kesehatan RI 1995

3.4.2 Kekerasan tablet Departemen Kesehatan RI 1995

Kekerasan tablet diukur dengan menggunakan alat Hardness Tester. Tablet yang akan diuji diletakan pada posisi vertikal diantara dua posisi logam penjepit dari alat pengukur kekerasan. Setelah itu tekan tombol start pada alat sehingga logam penjepit bergerak dan tablet pecah. Catat nilai yang tertera pada alat ketika tablet hancur. Kekerasan tablet dinilai dengan satuan kgcm 2 atau Kp. Kekuatan tekan minimum yang sesuai untuk tablet adalah 4 kgcm 2 Lachman et al. 1994.

3.4.3 Keregesan tablet Departemen Kesehatan RI 1995

Sebanyak 20 tablet yang sudah dibebas debukan ditimbang, setelah itu dimasukan kedalam alat uji keregesan tablet. Alat diset dengan kecepatan 25 rpm selama 4 menit. Setelah itu tablet dikeluarkan dan dibebaskan debukan kembali. Selanjutnya tablet yang sudah dibebas debukan ditimbang guna mengetahui perbedaan berat sebelum dan sesudah uji. Tablet yang baik memiliki keregesan 1. Departemen Kesehatan RI 1995. Rumus perhitungan kekerasan tablet hisap adalah sebagai berikut: Keregesan tablet = W1- W2 x 100 W1 Keterangan : W1= Bobot tablet sebelum diuji W2= Bobot tablet setelah diuji

3.4.4 Uji organoleptik

Uji organoleptik dengan menggunakan indera manusia sebagai instrumennya. Pengujian organoleptik dimaksudkan untuk mengetahui peneriman sensori terhadap produk tablet hisap dengan 30 orang panelis untuk mengungkapkan tanggapan pribadinya terhadap warna, aroma, rasa, kenampakan dan tekstur dimana tanggapan tersebut dapat berupa suka atau tidak suka yang divisualisasikan dengan angka 1 hingga 9. 3.4.5 Analisis kadar air AOAC 1995 Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen daam oven pada suhu 102-105 ○ C selama 30 menit. Cawan tersebut diletakan kedalam desikator kurang lebih 30 menit hingga dingin dan ditimbang hingga beratnya konstan. Kemudian cawan dan sampel seberat 1-2 gram ditimbang terlebih dahulu. Cawan dimasukan kedalam oven dengan suhu 102-105 ○ C selama 6 jam. Cawan tersebut dimasukan kedalam desikator dan dibiarkan hingga dingin kemudian ditimbang, penimbangan diulang sampai berat konstan. Perhitungan kadar air: Keterangan: A= Berat cawan kosong gram B = Berat cawan dengan sampel gram C = Berat cawan dengan sampel setelah dikeringan gram

3.4.6 Analisis kadar abu AOAC 1995

Cawan abu porselen dikeringkan didalam oven selama 30 menit dengan suhu 105 ○ C, lalu didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang. Sampel sebanyak 2-5 gram yang telah dihomogenkan dimasukan kedalam cawan abu porselen. Cawan abu porselen dipijarkan dalam tungku pengabuan bersuhu sekitar 300-400 ○ C sampai tidak berasap. Selanjutnya cawan dimasukan kedalam tanur pada suhu 600 ○ C selama 6 jam. Proses pengabuan dilakukan sampai abu berwarna putih. Setelah itu cawan porselen didinginkan dalam desikator selama 30 menit, kemudian ditimbang beratnya Perhitungan kadar abu: Keterangan: A= Berat cawan abu poselen kosong gram B = Berat cawan abu porselen dengan sampel gram C = Berat cawan abu porselen dengan sampel setelah dikeringkan

3.4.7 Analisis kadar protein AOAC 1995

Prinsip dari analisis protein, yaitu untuk mengetahui kandungan protein kasar Crude protein pada suatu bahan. Tahap-tahap yang dilakukan terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. 1 Tahap destruksi Sampel ditimbang seberat 1 gram, kemudian dimasukan kedalam tabung Kjeltab selanjutnya ditambahkan 10 ml H 2 SO 4 . Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukan kedalam alat pemanas dengan suhu 400 ○ C. Proses destruksi dilakukan sampai bening. 2 Tahap Destilasi Isi labu dituangkan kedalam labu destilasi, lalu ditambahkan dengan aquades 50 ml. Air bilasan juga dimasukan kedalam alat destilasi dan ditambahkan larutan NaOH 40 sebanyak 20 ml. Cairan dalam ujung kondensor ditampung dalam erlenmeyer 125 ml berisi larutan H 3 BO 3 dan 3 tetes indikator Cairan methyl red dan brom cresol green yang ada dibawah kondensor. Destilasi dilakukan sampai diperoleh kadar abu = x 100 200 ml destilat yang bercampur dengan H 3 BO 3 dan indikator dalam erlemeyer. 3 Tahap titrasi Titrasi dilakuan dengan menggunakan HCL 0,1 N sampai terjadi perubahan warna menjadi merah warna asam borat semula. Perhitungan jumah nitrogen dalam bahan: Nitrogen= Kadar Protein = nitrogen x faktor konversi 6,25.

3.4.8 Analisis kadar lemak AOAC 1995

Sampel seberat 2 gram W 1 dimasukan kedalam kertas saring dan dimasukan kedalam selonsong lemak, kemudian dimasukan kedalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya W 2 dan disambungkan dengan tabung soxlet. Selongsong lemak dimasukan kedaam ruang ekstraktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Tabung reaksi dipasang pada alat destilasi soxhlet, lalu dipanaskan pada suhu 40 ○ C dengan menggunakan pemanas listrik selama 6 jam. Pelarut lemak n-heksan yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung diruang eksekutor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali kedalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringan dengan oven 105 ○ C, setelah itu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan W 3 Perhitungan kadar lemak Keterangan : W 1 = Berat sampel gram W 2 = Berat labu lemak tanpa lemak gram W 3 = Berat abu lemak dengan lemak gram.

3.4.9 Uji aktivitas antioksidan Molyneux 2004

Biomassa kering Spirulina platensis dan tablet hisap Spirulina dilarutkan dalam metanol p.a. dengan konsentrasi 200, 400, 600 800 dan 1000 ppm. Antioksidan alami alfa tokoferol digunakan sebagai pembanding dan kontrol positif, dibuat dengan cara dilarutkan dalam pelarut metanol p.a. dengan konsentrasi 2, 4, 6 dan 8 ppm. Larutan DPPH yang akan digunakan, dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 1 mM. Proses pembuatan larutan DPPH 1 mM dilakukan dalam kondisi suhu ruang dan terlindung dari cahaya matahari. Larutan bahan baku, produk dan larutan antioksidan pembanding tokoferol yang telah dibuat, masing-masing diambil 4,5 ml dan direaksikan dengan 500 µl larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi yang berbeda dan telah diberi label. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30 menit dan diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 517 nm. Absorbansi dari larutan blanko juga diukur untuk melakukan perhitungan persen inhibisi. Larutan blanko dibuat dengan mereaksikan 4,5 ml pelarut metanol dengan 500 µl larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi. Aktivitas antioksidan dari masing-masing contoh dan antioksidan pembanding alfa tokoferol dinyatakan dengan persen inhibisi, yang dihitung dengan formulasi sebagai berikut: inhibisi = Absorban blanko – Absorban contoh x 100 Absorban blanko Nilai konsentrasi contoh bahan baku, produk ataupun antioksidan pembanding tokoferol dan persen inhibisinya diplot masing-masing pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linear. Persamaan regresi linear yang diperoleh dalam bentuk persamaan y = a + bx digunakan untuk mencari nilai IC 50 inhibitor concentration 50 dari masing-masing contoh dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x yang akan diperoleh sebagai IC 50 . Nilai IC 50 menyatakan besarnya konsentrasi larutan contoh ekstrak ataupun antioksidan pembanding alfa tokoferol yang dibutuhkan untuk mereduksi radikal bebas DPPH sebesar 50. 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penelitian Pendahuluan

Penelitian pendahuluan bertujuan untuk menentukan bahan pengikat yang baik dalam pembuatan tablet hisap Spirulina yang digunakan sebagai bahan acuan pada penelitian utama. Formulasi penentuan bahan pengikat tablet hisap ini menggunakan bahan baku Spirulina komersial dengan perbedaan jenis bahan pengikat tablet. Formulasi tersebut dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4 Formulasi penentuan bahan pengikat tablet hisap Spirulina komersial Jenis Bahan Formula 1 Formula 2 Formula 3 Spirulina platensis 62,5 500mg 62,5 500mg 62,5 500mg Sorbitol 29 29 29 Talk 1 1 1 Mg Stearat 1 1 1 Asam sitrat 0,5 0,5 0,5 Aerosil 3 3 3 Avicel 3 - - HPMC - 3 - Gum arab - - 3 Bobot tablet = 800 mg Keterangan : Modifikasi Rahingtyas 2008 Berdasarkan formulasi dengan perbedaan bahan pengikat, formulasi terbaik tablet hisap Spirulina adalah formula 1 dan 2 dengan bahan pengikat avicel dan HPMC. Hal ini diperoleh berdasarkan kenampakan dan kerapuhan tablet. Avicel dan HPMC hydroxypropyl methylcellulose merupakan bahan pengikat yang baik dalam pembuatan tablet dengan metode kempa langsung. Avicel atau selulosa mikrokristalin memiliki sifat alir yang baik. Selain digunakan sebagai pengikat, avicel juga berperan sebagai bahan pengisi dan penghancur di dalam mulut. HPMC adalah pengikat dan perekat yang umum digunakan. HPMC berperan sebagai pengikat dalam keadaan kering pada pencetakan langsung, sedangkan larutan HPMC berperan sebagai bahan perekat Lachman 1994. Formula 3 dengan bahan pengikat gum arab memiliki kenampakan yang kurang menarik dan tablet yang dihasilkan lebih rapuh dibandingkan dengan tablet lain, hal ini disebabkan gum arab memiliki komposisi dan penampilan yang berbeda- beda tergantung pada sumbernya. Penambahan gum arab kurang dari 5 akan menghasilkan tekstur yang rapuh mudah hancur, sedangkan jika lebih dari 5 akan menghasilkan mouthfeel yang berpasir. Bahan ini lebih efektif bila ditambahkan dalam bentuk larutan pada pembuatan granul dari pada bentuk kering ke formula pencetakan langsung Purushotham et al. 2011

4.2 Penelitian Utama