18
diendapkan kemudian dibilas untuk purifikasi protein rekombinan. Aliran sampel FT ditampung. Selanjutnya matriks dibilas dengan 5×CV dapar pencuci. Fraksi
washing W ditampung dan difraksinasi setiap 1×CV w1, w2, w3, w4, w5.
Kemudian sampel dielusi dengan dapar elusi yang mengandung 100 mM imidazol. Fraksi elusi E ditampung setiap 1×CV e1 – e8. Protein hasil
purifikasi dianalisis elektroforesis dengan teknik SDS-PAGE. Konsentrasi protein diukur menggunakan Qubit
®
Fluorometer Invitrogen.
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Konstruksi Protein Fusi anti-EGFRvIII scFv dengan HPRmut
4.1.1 Subkloning gen anti-EGFRvIII scFv ke dalam plasmid pPICZαA
Plasmid pPICZα yang mengandung gen anti-EGFRvIIIscFv pPICZαA- scFv-41 telah berhasil dikonstruksi dan dan dilaporkan Hertati 2013. Gen scFv
diinsersikan pada situs XhoI setelah sinyal sekresi mating factor-α MF- α untuk sekresi protein rekombinan keluar sel. Plasmid pPICZα-scFv telah diverifikasi
dengan teknik sekuensing dan selanjutnya digunakan dalam kontruksi fusi protein antibodi. Plasmid ini digunakan untuk mengkonstruksi fusi protein scFv::HPR.
Fusi protein scFv::HPR memiliki ukuran yang relatif kecil sehingga diharapkan dapat bekerja efektif dalam penargetan terhadap sel atau jaringan tumor. Plasmid
pPICZα-scFv klon no.41 telah dikonfirmasi baik dari ukuran plasmid, sekuen gen, dan posisi gen dalam plasmid. Selanjutnya klon plasmid ini digunakan dalam
subkloning gen berikutnya. Vektor pPICZα dipilih dan digunakan karena diharapkan dapat mengekspresikan dan mensekresikan protein fusi rekombinan
yang sangat kompleks yang dikonstruksi dalam penelitian ini pada sel inang P. pastoris
. Protein fusi scFv::HPR sangat kompleks karena masing-masing domain protein fusi tersebut memiliki lebih dari satu ikatan disulfida.
4.1.2 Subkloning gen HPR ke dalam plasmid pPICZα-scFv
Gen HPR telah berhasil disisipkan ke dalam plasmid pPICZα yang mengandung gen anti-EGFRvIII scFv. Seleksi koloni transforman dilakukan
dengan metode PCR koloni terhadap 100 koloni transforman dengan pasangan primer HPR-F dan HPR-R untuk mendeteksi gen HPR yang terinsersi dalam
plasmid.
Gambar 6 Elektroforegram hasil PCR untuk seleksi plasmid rekombinan pPICZ- scFv-HPR pada E. coli transforman. A. Analisis PCR koloni untuk
seleksi gen HPR menggunakan primer HPR-F dan HPR-R. 1= penanda DNA; 2= kontrol negatif; 3-13= klon E. coli transforman. Klon positif
ditunjukkan dengan adanya pita DNA berukuran 400 pb.
B. Analisis
PCR koloni untuk seleksi fusi gen scFv::HPR menggunakan primer AOX-F dan AOX-R. M= penanda DNA; 1= kontrol negatif; 2-12= E.
coli transforman. Klon positif ditunjukkan dengan adanya pita DNA
berukuran 1650 pb.
20
Sampel yang positif menghasilkan produk PCR sekitar 400 pb Gambar 6A. Hasil dari PCR koloni didapatkan 90 dari 100 koloni positif tersisip gen
HPR . PCR koloni juga dilakukan untuk konfirmasi bahwa fusi gen scFv::HPR
telah terbentuk dengan menggunakan pasangan primer AOX1-F dan AOX1-R. Koloni yang diuji sebanyak 90 klon hasil PCR koloni sebelumnya. Klon yang
positif menghasilkan produk PCR sekitar 1650 pb Gambar 6B. Hasil analisis menunjukkan bahwa73 dari 90 koloni positif mengandung fusi gen scFv::HPR.
Orientasi gen HPR dalam plasmid diperiksa dengan teknik PCR dan analisis restriksi. Analisis PCR menggunakan pasangan primer HPR-F dan AOX1-R
terhadap 73 klon yang diduga telah terinsersi gen HPR. Klon yang mengandung gen sisipan dengan orientasi yang benar menghasilkan pita berukuran sekitar
650pb Gambar 7A. Dari hasil analisis diperoleh 42 koloni yang positif. Analisis restriksi menggunakan enzim XbaI menghasilkan 8 klon positif yang terpotong
Gambar 7B.Selanjutnya tiga dari delapan klon tersebut dianalisis lebih lanjut terhadap urutan nukleotidanya. Satu klon dengan urutan nukleotida yang benar
telah diperoleh, yaitu klon scFv-HPR44 Lampiran5. Riccio et al. 2012, melaporkan menggunakan teknik yang sama untuk mengkonstruksi fusi RNase
dan fragmen antibodi dengan ErbB2 receptor sebagai molekul targetnya yaitu ERB–HP-DDADD-RNase. Konstruk tersebut di subklon ke dalam vektor
pET22b+ dan diekspresikan pada E. coli BL21DE3. Molekul imunoRnase ini dilaporkan mampu menunjukkan aktivitas biologis baik pada domain antibodi
maupun domain RNasenya.
Gambar 7 Elektroforegram hasil PCR koloni A dan digesti plasmid B untuk seleksi plasmid rekombinan mengandung fusi gen scFv::HPR. A.
Analisis PCR koloni untuk konfirmasi orientasi gen HPR menggunakan primer HPR-F dan AOX-R
. M= penanda DNA ; 1=
kontrol negatif; 2-12= E. coli transforman. Klon positif ditunjukkan dengan adanya pita DNA berukuran 650 pb. B. Analisis restriksi
plasmid rekombinan menggunakan enzim XbaI.; 1= kontrol negatif; 2= penanda DNA; 3-10: plasmid rekombinan. Klon yang positif
ditunjukkan dengan adanya potongan DNA berukuran 400 pb.
Gen HPR telah berhasil difusikan pada ujung-C dari scFv pada plasmid pPICZα-scFv. Gambar 8 menunjukkan peta konstruksi fusi gen scFv::HPR dalam
plasmid pPICZα-scFv. Pada ujung-N, gen scFv difusi dengan sekuen sinyal
