Transformasi dan seleksi P. pastoris

22 Gambar 9 Uji kestabilan genetik dan seleksi insersi gen ganda pada koloni yeast transforman pada media YPDAzeo, dengan konsentrasi zeocin bertingkat: 0 µgml A, 100 µgml B, 200 µgml C, 500 µgml D, dan 1000 µgml E. Analisis multikopi gen dilakukan dengan menumbuhkan koloni transforman tunggal pada media YPDAzeo yang mengandung zeocin 100, 200, 500, dan 1000µgml Gambar 9. Sebagai kontrol digunakan media YPDA tanpa zeocin. Klon-klon transforman yang dihasilkan memiliki kemungkinan beragam dalam jumlah salinan gen atau plasmid yang terintegrasi ke dalam DNA genom. Untuk menguji klon-klon yang mengandung jumlah salinan gen beragam, klon transforman tersebut diidentifikasi dengan menumbuhkan transforman tersebut pada medium yang mengandung antibiotik zeocin secara bertingkat. Semua koloni transforman tumbuh baik pada media kontrol dan media dengan zeocin 100 µgµl. Pada konsentrasi zeocin 200 dan 500 µgml beberapa koloni mulai terlihat terhambat pertumbuhannya danhanya sekitar 93 dari jumlah klon tersebut yang tumbuh dengan baik.Sedangkan pada konsentrasi zeocin 1000 µgml, hanya sekitar 70 dari klon transforman tersebut yang dapat tumbuh dengan baik.Dalam penentuan jumlah salinan gen, Nordén et al. 2011 mengemukakan bahwa terdapat variasi dalam toleransi terhadap antibiotik. Hal tersebut dikarenakan adanya perbedaan dalam jumlah gen rekombinan diantara klon transforman Dengan asumsi bahwa gen Sh ble yang tergabung pada rasio yang sama dengan fragmen gen target, diperkirakan 1 salinan gen Sh ble gen resistensi zeocin merupakan syarat minimum untuk dapat tumbuh pada konsentrasi zeocin 100 µgml, 4 salinan gen untuk tumbuh pada konsentrasi 500 µgml dan 9 salinan gen untuk tumbuh pada konsentrasi 1000 µgml. Klon dengan salinan gen Sh ble sebanyak 17 salinan juga dilaporkan pada klon tarnsforman yang mampu tumbuh pada konsentrasi zeocin sebesar 2000 µgml Nordén et al. 2011. Plasmid pPICZα yang mengandung fusi gen scFv::HPR telah berhasil diintegrasikan ke dalam genom P. pastoris. Analisis terhadap genom DNA transforman dilakukan dengan metode PCR koloni terhadap 10 klon P. pastoris transforman. Dua pasang primer digunakan untuk konfirmasi integrasi gen HPR dan scFv dalam genom P. pastoris, yaitu pasangan primer HPR-F HPR-R dan VH101-F VH101-R. Hasil PCR koloni dari 10 transforman P. pastoris tersebut menunjukkan bahwa semua klon yang dianalisis memberikan pita DNA berukuran 400 pb Gambar 10A dan 750 pb Gambar 10B. Pita berukuran 400 pb adalah gen HPR, sedangkan pita berukuran 750 pb adalah gen scFv. Dari hasil PCR ini disimpulkan bahwa semua klon transforman yang dianalisis tersebut positif mengandung kedua gen tersebut HPR dan scFv. 23 Gambar 10 Elektroforegram hasil PCR koloni untuk konfirmasi insersi fusi gen scFv::HPR dalam genom P. pastoris transforman. A. PCR koloni menggunakan pasangan primer HPR-F dan HPR-R. M= penanda DNA; 1-10= galur P. pastoris transforman. Galur transforman yang positif mengandung gen HPR memberikan pita DNA berukuran 400 pb. B. PCR koloni menggunakan pasangan primer VH101-F dan VL101-R. M= penanda DNA; 1= kontrol positif; 2-11= galur P. pastoris transforman. Galur transforman yang positif mengandung gen scFv memberikan pita DNA berukuran 750 pb.

4.2 Konstruksi Protein Fusi anti-EGFRvIII scFv-GFP dengan HPRmut

4.2.1 Subkloning gen EGFP ke dalam plasmid pPICZα-scFv

Plasmid pPICZαAyang mengandung gen anti-EGFRvIII scFv pPICZα-scFv klon no.41 yang digunakan untuk mengkonstruk plasmid pPICZα-scFv-HPR digunakan juga untuk mengkonstruksi fusi protein scFv::GFP. Klon yang telah mengandung plasmid pPICZα-scFv-GFP digunakan untuk mengkonstruksi fusi protein scFv::GFP::HPR. Fusi gen tersebut mengandung sekuen peptida penghubung linker fleksibel yang pendek G 4 S n diantara scFv dengan GFP dan antara GFP dengan HPR, dengan n kelipatan 2 atau 1. Sekuen peptida penghubung tersebut diintroduksi melalui primer dengan teknik PCR. Peptida penghubung G 4 S digunakan karena peptida ini memiliki karakteristik menguntungkan seperti dapat memberikan fleksibilitas struktur protein fusi. Huang Shusta 2006 menggunakan peptida penghubung yang sama untuk fusi scFv atau scTCR dengan GFP, namun mereka menggunakan triplet G 4 S. Penggunaan peptida penghubung ini pada fusi protein scFv::GFP yang diekspresikan pada S. Cerevisiae menunjukkan hasil yang lebih baik dan membentuk struktur yang tepat dibandingkan dengan fusi protein yang sama namun tanpa peptida penghubung meskipun protein tersebut juga bisa diekspresikan Huang Shusta, 2006. Gen GFP telah berhasil diklon ke dalam plasmid pPICZα-scFv pada situs ClaI menghasilkan plasmid rekombinan pPICZα-scFv-EGFP. Sebanyak 115 koloni E. coli transforman di seleksi menggunakan PCR koloni menggunakan pasangan primer AOX1-F dan AOX1-R. Klon yang positif akan menghasilkan produk PCR berupa pita DNA berukuran 2000 pb Gambar 11A. Sebanyak 23 24 dari 115 klon memberikan hasil positif dan diduga mengandung gen sisipan GFP. Namun pada analisis lebih lanjut diketahui hanya 14 klon yang menunjukan orientasi gen yang benar. Klon tersebut dikonfirmasi dengan teknik PCR menggunakan pasangan primer EGFP-F dan AOX1-R. Klon yang memiliki gen GFP dengan orientasi yang benar menunjukkan pita DNA sekitar 1000 pb Gambar 11B. Dari empat klon yang dilakukan analisis sekuen DNA, satu klon menunjukkan urutan yang benar, yaitu klon nomor scFv-EGFP-A3 Lampiran 7 dan 8. Plasmid dari klon ini digunakan untuk subkloning berikutnya. Gambar 11 Elektroforegram hasil PCR untuk seleksi plasmid rekombinan pPICZ-scFv-GFP pada E. coli transforman. A. Analisis PCR koloni E. coli transforman dengan primer AOX-F dan AOX-R. M= penanda DNA; 1= kontrol negatif; 2-12= klon E. coli transforman; Klon positif ditunjukkan dengan adanya pita DNA berukuran 2000pb. B. Analisis PCR koloni untuk konfirmasi orientasi DNA sisipan pada E. coli transforman dengan primer GFP-F dan AOX-R. M= penanda DNA, 1= kontrol negatif; 2-12= Klon E. coli transforman. Klon positif ditunjukkan dengan adanya pita DNA berukuran 1000 pb. Gambar 12 menunjukkan peta konstruksi fusi gen scFv::GFP dalam plasmid pPICZα-scFv-GFP. Fragmen scFv dihubungkan dengan GFP dengan suatu peptida penghubung yang fleksibel, yaitu G 4 S 2 , yang dapat memberikan ruang untuk pelipatan protein yang independen dari masing-masing domain. Pada ujung-C ditambahkan sekuen penanda protein tag yaitu c-myc dan 6xHis untuk memudahkan proses deteksi dan purifikasi protein rekombinan. Gambar 12 Peta konstruksi fusi gen scFv::GFP dalam plasmid pPICZα-scFv- GFP. 5AOX1= promoter alkohol oksidase; α-faktor= sinyal sekresi; scFv= fragmen antibodi; L= linker, GGGSIDGGGGS; GFP= green fluorescent protein ; c-myc= penanda myc; 6xHis = polihistidine tag; STOP= kodon stop; AOX1TT = sekuen terminator alkohol oksidase.