Seleksi P. pastoris transforman

16

3.2.6 Ekspresi protein pada P. pastoris transforman

Setelah dilakukan proses seleksi, selanjutnya dilakukan uji ekspresi protein rekombinan dari beberapa galur transforman berdasarkan prosedur pada manual Pichia Expression Kit versi G Invitrogen. Kultur P. pastoris transforman dan non-transforman nt masing-masing ditumbuhkan pada media agar miring YPDAzeo dan YPDA. Satu ose kultur galur transforman dan galur non- transforman masing-masing ditumbuhkan dalam 2 ml media YPD cair yang mengandung zeocin atau tanpa zeocin. Kultur diinkubasi pada suhu 30°C dengan agitasi 250 rpm selama 24 jam. Kultur yang telah tumbuh selanjutnya diinokulasikan ke dalam 25 ml media produksi BMGY 1 ekstrak khamir, 2 pepton, 100 mM dapar potassium fosfat pH 6.0, 1.34 YNB, 4×10 -5 biotin, 1 gliserol, Lampiran 2. Kultur diinkubasi pada suhu 30°C dengan agitasi 250 rpm selama 24 jam. Setelah 24 jam kultur dipanen, biomasa sel dipisah dari media BMGY dan dipindahkan ke dalam media induksi BMMY 1 ekstrak khamir, 2 pepton, 100 mM dapar potassium fosfat pH 6.0, 1.34 YNB, 4×10 -5 biotin, 0.5 metanol. Biomassa sel pelet dan media kultur supernatan dipisahkan dengan cara sentrifugasi 5000 rpm, 15 menit, 4°C. Media kultur disingkirkan sedang biomasa sel diresuspensi dengan 5 ml media BMMY. Suspensi sel dipindahkan ke dalam 25 ml media BMMY yang baru dengan nilai OD 600 awal = 1. Metanol ditambahkan dengan konsentrasi 0,5 vv ke dalam kultur setiap 24 jam selama 3 hari. Kultur diinkubasi pada suhu 30°C dengan agitasi 250 rpm selama 2 hari. Pengambilan contoh dilakukan setiap 24 jam setelah diinduksi dengan metanol dan OD 600nm sel diukur. Kultur sel transforman dipanen dengan cara sentrifugasi 10.000 rpm, 15 menit, suhu 4°C. Biomasa sel disimpan pada suhu –20°C dan medium kultur bebas sel supernatan disimpan pada suhu 4°C untuk digunakan dalam analisis protein lebih lanjut. Sampel protein dianalisis dengan SDS-PAGE dan imunobloting slot blot atau western blot.

3.2.7 Pengujian insersi fusi gen pada genom Pichia

Pichia transforman dianalisis dengan teknik PCR koloni untuk mengetahui insersi fusi gen. Koloni PCR terhadap fusi gen scFv::HPR dilakukan menggunakan 2 reaksi PCR masing-masing menggunakan pasangan primer VH101FVL101R dan HPR FHPR R. Sedangkan untuk fusi gen scFv::GFP::HPR menggunakan pasangan primer VH101-F dan HPRmut-R. Volume reaksi PCR adalah 25 µl, terdiri dari 4 µl DNA cetakan, 2× PCR buffer, 75 pmol primer, 1 µl 3G Plant polimerase KAPA, dan dH 2 O. Siklus PCR ditetapkan 40 siklus.

3.2.8 Pengamatan sel dengan mikroskop fluoresen

Sel P. pastoris transforman mengandung gen GFP yang terfusi dengan gen antibody scFv dan gen HPR. Konstruksi fusi gen tersebut terintegrasi ke dalam DNA genomik pada galur-galur transforman. Pengamatan ekspresi protein rekombinan terhadap sel P. pastoris transforman setelah induksi dengan 17 methanol, dilakukan menggunakan mikroskop fluoresen Carl Zeiss, Apotome-2 dengan perbesaran 40×. Sel diamati menggunakan filter FITC.

3.2.9 Analisis ekspresi protein rekombinan dengan teknik imunoblotting slot blot dan SDS PAGE

Analisis protein dilakukan terhadap protein ekstraseluler yang dihasilkan. Analisis protein rekombinan dilakukan menggunakan metode slot blot dan SDS- PAGE. Komposisi gel akrilamid dan larutan dapar SDS PAGE pada Lampiran 4. Supernatan sel kultur dipanen dengan cara disentrifugasi kemudian dipresipitasi dengan larutan TCA trichloro acetic acid. Sampel protein rekombinan dianalisis menggunakan teknik slot blot. Sampel proein ditransfer ke membran nitroselulosa melalui proses vaccum. Setelah itu membran diinkubasi dengan 5 susu bebas lemak blocking yang dilarutkan dalam PBS phospate buffered saline-Tween20 selama 1 jam. Kemudian membran dicuci washing dengan PBS-Tween20 selama 5 menit diulang 3 kali. Membran diinkubasi dengan 2 µl antibodi primer anti-His dalam 10 susu bebas lemak dalam PBS-Tween20 selama 1 jam. Setelah itu, membran dicuci dengan PBS-Tween20 selama 5 menit sebanyak 3 kali. Membran diinkubasi kembali dengan antibodi sekunder anti-mouse IgG dalam 10 susu bebas lemak selama 1 jam. Membran dicuci kembali dengan PBS-Tween20 selama 5 menit sebanyak 3 kali. Untuk proses deteksi membran diinkubasi dengan larutan staining yang mengandung substrat alkaline peroxidase.

3.2.10 Purifikasi protein rekombinan menggunakan kromatografi kolom afinitas

Sampel protein rekombinan pada medium kultur bebas sel supernatan dipekatkan menggunakan amonium sulfat. Sebanyak 70 ml sampel dipresipitasi dengan amunium sulfat dengan konsentrasi saturasi 80. Sampel ditempatkan pada labu erlenmeyer, ditambahkan 37,3 gr ammonium sulfat sedikit-demi-sedikit serta diaduk sampai larut dengan batang pengaduk magnet pada suhu 4°C. Setelah larut seluruhnya, sampel protein diinkubasi selama semalam pada suhu 4°C. Sampel dipindahkan ke dalam tabung sentrifus dan disentrifugasi 10.000 rpm, 10 menit, 4°C. Supernatan disingkirkan, sedang endapan protein pellet dilarutkan dengan 1ml dapar fosfat 50mM pH 7,4. Sampel hasil presipitasi 1,5ml didialisis menggunakan tabung dialisis dengan pori 3.500 Da SpectraPor ® Dialysis Membrane terhadap dapar fosfat 50mM pH 7,4. Purifikasi dengan kromatografi afinitas dilakukan metode IMAC immobilized-metal affinity chromatography. Beberapa persiapan dilakukan terhadap matriks dan sampel protein. Persiapan sampel dilakukan dengan menambahkan dapar pengikat ke dalam sampel hasil dialisis perbandingan 10:1. Komposisi larutan dapar purifikasi terdapat pada Lampiran 4. Untuk persiapan matriks, sebanyak 250µl resin Ni-NTA Qiagen diequilibrasi dengan dapar pengikat sebanyak 5 kali kolom volume CV. Sampel ditambahkan ke dalam matriks di dalam tabung tertutup dan diinkubasi selama semalam pada suhu 4°C dengan rotasi. Sampel dan matriks dimasukkan ke dalam kolom purifikasi,