Transformasi, seleksi dan analisis P. pastoris

28 terintegrasi dalam genom berkorelasi dengan jumlah protein yang diekspresikan. Semakin banyak salinan gen, semakin tinggi ekspresi protein rekombinan. Vektor pPICZα membawa gen resistensi zeocin yang dapat digunakan dalam menyeleksi transforman yang mengandung multikopi gen. Adanya insersi multikopi gen dapat diidentifikasi melalui peningkatan resistensi terhadap zeocin. Analisis multikopi gen dilakukan dengan menumbuhkan koloni transforman tunggal pada media YPDA yang mengandung zeocin dengan konsentrasi meningkat 100, 200, 500, dan 1000 µgml Gambar 15. Sebagai kontrol digunakan media YPDA tanpa zeocin. Uji multikopi gen dilakukan dengan menumbuhkan koloni transforman tersebut pada medium dengan konsentrasi zeocin meningkat. Sebagain besar koloni transforman tumbuh stabil pada media kontrol dan media dengan zeocin sampai dengan konsentrasi 500 µgml. Sedangkan pada media dengan konsentrasi zeocin 1000 µgml, beberapa koloni tampak terhambat pertumbuhannya. Diperoleh sekitar 53 koloni yang stabil pertumbuhannya. Sama halnya dengan fusi gen scFv::HPR, penentuan jumlah salinan gen diprediksi berdasarkan Nordén et al.2011. Diperlukan minimal satu salinan gen Sh ble yang menyandi resistensi terhadap zeocin untuk dapat tumbuh pada medium dengan 100 µgml zeocin, 4 salinan gen pada 500 µgml dan 9 salinan gen pada 1000 µgml. Klon mengandung 17 salinan gen dapat dijumpai pada transforman yang tumbuh baik pada medium dengan zeocin 2000 µgml. Gambar 16 Elektroforegram hasil PCR koloni dari beberapa klon yeast transforman untuk konfirmasi integrasi fusi gen scFv::GFP::HPR dalam genom P. pastoris. Ukuran panjang dari fusi gen scFv::GFP::HPR adalah sekitar 1900 pb. Tanda panah menunjukkan pita DNA dari fusi gen yang dimaksud. M= penanda DNA; 1-2 =kontrol negatif; 3-12 = klon P. pastoris transforman. Plasmid pPICZα yang mengandung fusi gen scFv::GFP::HPR telah berhasil diintegrasikan ke dalam genom P. pastoris. Seleksi genom transforman dilakukan dengan metode PCR koloni terhadap 10 koloni transforman. Pasangan primer VH101-F dan HPRmut-R digunakan untuk mendeteksi fusi gen tersebut dalam genom yeast. Dari 10 koloni yang diseleksi, semua koloni menunjukkan produk PCR berupa pita DNA berukuran sekitar 1900 pb Gambar 16. Ukuran dari fusi gen scFv:GFP::HPR adalah 1900 pb. Dari hasil analisis ini diduga semua transforman P. pastoris tersebut telah mengandung fusi gen scFv:GFP::HPR. 29 Galur P. pastoris transforman yang digunakan dalam uji ekspresi protein rekombinan menunjukan fenotipe berupa pendaran fluoresen hijau. Gambar 17 menunjukkan hasil pengamatan terhadap sel P. pastoris transforman yang berpendar di bawah mikroskop flouresen. Pendaran fluoresen hijau tersebut berasal dari protein GFP yang merupakan bagian dari protein fusi rekombinan tersebut. Huang dan Shusta 2006 menyatakan bahwa GFP banyak digunakan sebagai penanda dinamika intraseluler dan lokalisasi protein. Efisiensi sekresi protein scFv dan protein fusi scFv bervariasi, dan GFP dapat berperan sebagai penanda untuk mengetahui jalur sekresi protein heterolog. Protein fusi yang disekresikan ini diharapkan membentuk fusi protein yang fungsional, karena gugus GFP yang aktif hanya akan berpendar bila protein tersebut mengalami maturasi dan terfolding dengan tepat. Perbedaan posisi relatif protein fusi GFP dan scFv, baik diujung-Natau -C tidak berpengaruh terhadap jumlah protein yang dihasilkan namun lokalisasi intraselulernya memiliki pola yang berbeda. Gambar 17 Pengamatan P. pastoris transforman dan non-transforman dengan mikroskop flouresen pada fase kontras lajur kiri dan fase flouresen lajur kanan. A. Sel non transforman tanpa GFP kontrol ; B dan C. Sel transforman yang mengandung GFP dari klon no. 48 dan 50. Hal ini membuktikan bahwa gen penanda GFP yang diintegrasikan pada vektor pPICZα dapat terekspresi pada sel P. pastoris. Pengamatan dengan mikroskop fluoresen terhadap sel transforman menunjukkan bahwa pada sebagian sel tampak seperti adanya partikel berfluoresen yang terjebak di dalam sel, ada yang keseluruhan sel berpendar hijau, atau sel berpendar dengan tingkat pendaran bervariasi. Pembentukan partikel flouresen di dalam sel ini dapat terjadi karena pelipatan fusi protein dengan GFP terjebak dalam sitoplasma. Hal tersebut kemungkinan terjadi sebagai konsekuensi dari tingkat kelarutan GFP yang tinggi dalam sitoplasma dan karena ekspresi protein heterolog yang sangat tinggi. 30 Namun demikian ada kemungkinan lain dimana terjadi transfer GFP ke beberapa organel Zupan et al. 2004. Sementara itu pada sebagian sel yang memiliki efisiensi sekresi tinggi akan menunjukkan pendaran lebih lemah, disebabkan protein yang diproduksinya segera disekresikan keluar sel secara efektif. Sedangkan bila sel mangalami kendala dalam proses sekresi protein, seperti inefektif dalam memproses atau memotong sinyal peptida, maka kemungkinan protein tersebut akan terakumulasi pada permukaan sel. Proses pemotongan sinyal peptida umumnya berlangsung pada tahap akhir proses protein di retikulum endoplasmik ER atau pada permukaan sel dimana banyak dijumpai endoprotease yang memproses protein ekstraselular. Gambar 18 Ekspresi protein khimera scFv::EGFP::HPR dari beberapa klon P. pastoris transforman 6 klon, dianalisis dengan metode slot-blot A dan elektroforesis gel SDS PAGE B. A Analisis slot-blot protein sampel duplo; kolom 1: kontrol negatif; kolom 2-7: protein ekstraseluler dari kultur media yeast transforman. B Elektroforesis gel protein rekombinan dari sampel media kultur yang dipekatkan dari klon no.48 lajur-1 dan klon no.50 lajur-2. Fusi protein scFv rekombinan yang dikonstruksi mengandung sekuen penanda his-tag 6xHis pada ujung-C. His-tag ini umumnya digunakan pada analisis protein untuk memudahkan produksi, purifikasi, dan deteksi protein yang diinginkan. Karena itu analisis imunoblotting dengan metode slot blot dilakukan menggunakan antibodi anti his-tag sebagai antibodi primer. Dari hasil analisis slot blot terhadap enam sampel terpilih terlihat bahwa protein fusi rekombinan tersebut terdeteksi dengan baik menggunakan anti his-tag Gambar 18A. Analisis slot blot merupakan teknik semi-kualitatif yang dapat digunakan untuk deteksi dan karakterisasi protein rekombinan total yang diekspresikan baik pada E. coli maupun sistem ekspresi lain seperti yeast. Sedangkan elektroforesis SDS-PAGE dan western blot dapat mendeteksi protein target lebih spesifik dengan sensitivitas lebih tinggi dan dapat memperlihatkan bobot molekul yang jelas dari protein yang dianalisis Zhu et al. 2005. Purifikasi protein menggunakan kromatografi kolom afinitas Ni-NTA agarose Qiagen dilakukan untuk isolasi dan purifikasi protein rekombinan yang dihasilkan oleh P. pastoris. Hasil purifikasi dianalis lebih lanjut dengan elektroforesis SDS-PAGE dan western blot. Dari hasil SDS-PAGE Gambar 19A terlihat protein bahwa protein fusi rekombinan dapat diisolasi dan dielusi dengan 31 larutan imidazol Gambar 19A, lajur-3, 4, 5. Tampak pada gel bahwa protein hasil isolasi memiliki tingkat kemurnian cukup baik, bila dibandingkan dengan sampel awal protein tersebut Gambar 19A, lajur-2. Protein target secara efisien dipertahankan pada kolom matriks. Setelah proses pencucian kolom untuk menghilangkan protein kontaminan lain, protein target dapat dengan mudah dielusi baik dengan mengatur kondisi pH pada kolom atau dengan menambahkan larutan imidazol ke dalam kolom Bornhorst Falke 2000. Analisis western blot Gambar 19B juga dilakukan untuk mengetahui bobot molekul protein scFv rekombinan yang dihasilkan. Dari analisis western blot tampak adanya pita protein yang terdeteksi pada membran yang menunjukkan ukuran dari pita tersebut berkisar 55 kDa Gambar 19B. Pita protein tersebut tampak jelas pada membran dan hanya ada satu pita protein yang signifikan. Hal ini menunjukkan bahwa pita protein tersebut merupakan protein target yang dihasil oleh P. pastoris transforman. Berat molekul protein fusi scFv::GFP::HPR secara teoritik adalah 70 kDa yang dihitung menggunakan program ‘Compute pIMw tool’ dari salah situs pangkalan data protein http:web.expasy.orgcgi-bincompute_pipi_tool. Perhitungan teoritis didasarkan pada jumlah dan jenis asam amino penyusun dengan algoritma yang relatif kompleks, namun perhitungan tersebut tidak sesuai dengan berat molekul yang diperoleh melalui eksperimental, yaitu 55 kDa Lampiran 10. Perbedaan ukuran molekul protein antara perhitungan secara teoritis dengan perhitungan secara eksperimental pada gel SDS PAGE dapat terjadi, seperti yang juga dialami oleh Trung et al. 2006 dan dapat disebabkan oleh beberapa hal. Trung et al. 2006 melakukan fusi protein rekombinan ButaITGNA yang mengandung polipeptida ButaIT yang difusi pada ujung-N dari snowdrop lectin. Protein fusi tersebut dimigrasikan pada SDS PAGE dan menunjukkan perbedaan ukuran dari ukuran teoritis yang diduga karena polipeptida toksin tersebut memiliki kandungan sistein yang tinggi. Nicot et al. 2002 memprediksi protein humanrat M-CPTI dan pig L-CPTI bermigrasi lebih cepat pada gel elektroforesis SDS dibandingkan dengan berat molekul yang diprediksi. Fenomena ini diperkirakan karena protein mempertahankan anomali pola migrasi pada produksi secara in vitro, karena adanya perbedaan intrinsik pada struktur primer pada kedua protein. Menurut Rath et al. 2009 pergeseran berat molekul protein pada gel SDS PAGE tampaknya menjadi kejadian yang relatif umum. Penyebab perbedaan migrasi ini antara lain karena perubahan pengikatan SDS dan konformasi jepit rambut hair pin. Keduanya merupakan komponen yang saling terkait yang dianalogikan dengan pelipatan protein. Pertama, pelapisan dari daerah transmembran oleh rantai asil detergen dan adopsi konformasi heliks, dan kedua kompetisi diantara protein-protein dan kontak antara protein dengan detergen. Perbedaan ukuran antara perhitungan teoritis dan perhitungan pada gel SDS PAGE ini juga diduga karena adanya proses modifikasi pascatranslasi pada protein yang dihasilkan dari organisme eukariotik seperti yang diproduksi pada P. pastoris. Proses ini termasuk glikosilasi yang berfungsi secara biologis untuk berbagai hal, seperti pembentukan dinding sel, pembelahan sel, perkembangan siklus sel, dan pelipatan protein Bobrowicz et al. 2004. Powers et al. 2001 mengemukakan bahwa heterogenitas berat molekul yang diamati bisa disebabkan oleh perbedaan dalam proses glikosilasi atau pengolahan sinyal peptida yang digunakan. Hal tersebut telah dibuktikan dengan sekuensing N- terminal dan analisis deglikosilasi dari hasil purifikasi human IgG1 scFv-Fc 32 protein yang menghasilkan N-glikosilasi ditunjukkan oleh pita yang lebih tingi sedangkan protein yang tidak terglikosilasi ditunjukkan oleh pita yang lebih rendah. Gambar 19 Isolasi dan purifikasi protein fusi rekombinan scFv::GFP::HPR dari salah satu galur P. pastoris transforman. Analisis protein dilakukan dengan teknik SDS-PAGE A dan western blot B. 1: penanda protein; 2: crude protein; 3-5: fraksi elusi hasil purifikasi protein dengan kolom afinitas. Penentuan konsentrasi protein dilakukan menggunakan Qubit ® Fluorometer invitrogen. Pada sampel protein dari proses purifikasi didapatkan konsentrasi protein rekombinan pada fraksi elusi E1, E2, dan E3 masing-masing 720, 484 dan 376 µgml dengan volume dari masing-masing fraksi adalah 250 µl. Dengan demikian estimasi total protein rekombinan hasil purifikasi dari 3 fraksi elusi saja mencapai 15,85 mg per L kultur. Tingkat ekspresi protein fusi rekombinan pada penelitian ini setara dengan hasil yang pernah dilaporkan penelitian lainnya untuk jenis protein yang hampir sama. Huang Shusta 2006 menyebutkan tingkat ekspresi protein dari antibodi untai tungal sekitar 20 mgL kultur, menggunakan sel inang S. cerevisiae. Hasil yang hampir sama didapatkan dari purifikasi total protein rekombinan scFv anti-ED-B domain fibronectin pada P. pastoris sebesar 5 sampai 20 mg per liter kultur Marty et al. 2001. Sementara itu Maeng et al. 2012 melaporkan produksi protein rekombinan anti-BNP scFv hasil purifikasi pada P. pastoris mencapai 150 mg per liter kultur. Hal ini menunjukkan bahwa jenis protein yang berbeda dapat mengalami pengolahan jalur sekresi yang berbeda dan mengalami perbedaan hambatan sekresi yang berbeda pula. 5 SIMPULAN DAN SARAN

5.1 Simpulan

Plasmid rekombinan pPICZ-scFv-HPR dan pPICZ-scFv-GFP-HPR telah berhasil dikonstruksi. Masing-masing fusi gen tersebut telah berhasil ditransformasikan dan diekspresikan pada P. pastoris. Efisiensi transformasi pada P. pastoris sebesar 54 cfuug DNA dan 102 cfuug DNA masing-masing untuk konstruk fusi gen pertama scFv::HPR dan kedua scFv::GFP::HPR. P. pastoris transforman yang diperoleh dari konstruk fusi gen scFv::GFP::HPR mengeluarkan pendaran fluoresen hijau yang menunjukkan bahwa gen GFP terekspresi dengan baik. Protein fusi rekombinan tersebut telah berhasil diekspresikan dan disekresikan dari P. pastoris seperti yang ditunjukkan dari hasil analisis imunobloting dan SDS PAGE. Contoh protein rekombinan fusi gen scFv::GFP::HPR telah berhasil diisolasi dan dipurifikasi menggunakan kromatografi kolom afinitas dengan estimasi total protein rekombinan sebesar 15,85 mg per liter kultur.

5.2 Saran

Seleksi dan ekspresi protein fusi rekombinan dari galur P. pastoris transforman perlu dianalisis lebih lanjut untuk mengamati integritas dari protein fusi yang dihasilkan. Seleksi juga perlu dilakukan terhadap galur-galur transforman lain yang lebih banyak untuk mengetahui galur dengan tingkat ekspresi yang lebih baik. Selanjutnya perlu juga dilakukan pengujian terhadap fungsionalitas dan aktivitas protein fusi yang dihasilkan, seperti uji aktifitas ribonuclease dari HPR dan uji pengikatan afinitas terhadap molekul antigen target EGFRvIII dari fragmen antibody scFv. DAFTAR PUSTAKA Ahmad ZA, Yeap SK, Ali AM, Ho WY, Alitheen NBM, Hamid M. 2012. Review Article : scFv Antibodi: Principles and Clinical Application. Clin Develop Immunol Volume 2012, doi:10.11552012980250. Ardelt W, Ardelt B, Darzynkiewicz Z. Ribonucleases as potential modalities in anticancer therapy . 2009. European J of Pharmacol 625 181–189. Atalay G, Cardoso F, Awada A, Piccart MJ. 2003. Novel therapeutic strategies targeting the epidermal growth factor receptor EGFR family and its downstream effectors in breast cancer. Ann Oncol, 14: 1346–1363. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K editors. 2002. Short Protocol in Molecular Biology. 5 th Edition. John Wiley Sons Inc. Balamurugan V, Reddy GR, Suryanarayana VVS. 2007. Pichia pastoris: A notable heterologous expression system for the production of foreign proteins—Vaccines. Indian J Biotechnol, 6: 175-186. Bell P, Vandenberghe LH, Wu D, Johnston J, Limberis M, Wilson JM. 2007. A Comparative Analysis of Novel Fluorescent Proteins as Reporters for Gene Transfer Studies. J Histochem Cytochem. 559: 931–939 . DOI: 10.1369jhc.7A7180.2007. Benito A, Ribó M, Vilanova M. 2005. On the track of antitumour ribonucleases. Mol Biosyst

14: 294-302. doi: 10.1039B502847G.

Binyamin L, Borghaei H, Weiner LM. 2006. Cancer therapy with engineered monoclonal antibodies. Update on cancer therapeutics 1: 147–157. Bobrowicz P, Davidson RC, Li H, Potgieter TI, Nett JH, Hamilton SR, Stadheim TA, Miele RG, Bobrowicz B, Mitchell T, Rausch S, Renfer E, Wildt S. 2004. Engineering of an artificial glycosylation pathway blocked in core oligosaccharideassembly in the yeast Pichia pastoris: production of complex humanized glycoproteins with terminal galactose. Glycobiol 149: 757-766. doi:10.1093glycobcwh104. Bornhorst JA, Falke JJ. 2000. Purification of Proteins Using Polyhistidine Affinity Tags. Methods Enzymol, 326 : 245–254. Borriello M, Laccetti P, Terrazzano G, D’Alessio G, De Lorenzo C. 2011. A novel fully human antitumour immunoRNase targeting ErbB2-positive tumours. Br J Cancer 104, 1716 – 1723. Bretthauer RK. 2003. Genetic engineering of Pichia pastoris to humanize N- glycosylation of proteins. TRENDS Biotechnol 21 :11. Casey JL, Coley AM, Tilley LM, Foey M. 2000. Gren Fluorescent antibodies : Novel in vitro tools. Prot Eng 13 6 : 445-452.