15
gen tersebut diamplifikasi kembali menggunakan pasangan primer yang mengandung situs restriksi XbaI yaitu HPRmut-F-G4S-Xba dan HPRmut-R-Xba-
mod. Amplifikasi menggunakan PCR dilakukan dengan total volume 50 µl, yang mengandung 1 µl DNA cetakan, 20 pmol primer, 0.2 mM dNTPs, 0.4 µl Phire hot
start DNA polimerase Thermo, dan dH
2
O. Fragmen gen HPRmut dan plasmid pPIC-scFv-GFP dipotong dengan enzim XbaI Thermo. Fragmen DNA hasil
potong dielektroforesis, dipurifikasi dan diekstraksi dari gel dengan kit kolom purifikasi DNA GeneAid. Gen HPRmut dan plasmid pPICZα-scFv-GFP diligasi
dan ditransformasi ke dalam E. coli TOP10 F menurut protokol umum biologi molekuler Ausubel, 2002. E. coli transforman diseleksi pada medium LS-LB
agar dan zeocin 25 µgml, Lampiran 2. E. coli transforman dianalisis dengan teknik PCR koloni menggunakan pasangan primer AOX1-F dan AOX1-R.
Volume reaksi PCR adalah 20 µl, terdiri dari 1 µl DNA cetakan, 20 pmol primer, 0.2 mM dNTPs, 0.5 µl Dream Taq DNA polimerase Thermo, dan dH
2
O. Klon yang positif mengandung DNA sisipan selanjutnya dianalisis untuk menentukan
orientasi gen dengan cara PCR menggunakan pasangan primer HPRmut-F dan AOX1-R. Plasmid rekombinan yang diperoleh dianalisis potong menggunakan
enzim restriksi XbaI Thermo dan dianalisis urutan nukleotidanya di 1
st
Base .
3.2.4 Transformasi P. pastoris dan seleksi sel transforman
Plasmid rekombinan pPICZαA-scFv-GFP-HPR dilinierisasi dengan enzim SacI
Thermo. Transformasi pada sel khamir dilakukan dengan teknik elektroporasi dilakukan berdasarkan protokol dari Invitrogen dengan beberapa
modifikasi. Sebanyak 0,5 μ g DNA yang telah dilinierisasi dengan enzim SacI dimasukkan ke dalam 60 μ L sel kompeten P. pastoris strain SMD1168H dalam
kuvet elektroporasi 2 mm gap, diinkubasi dalam es selama 2 menit. Campuran sel dan DNA dalam kuvet selanjutnya diberi kejut listrik menggunakan Gene
Pulser ΙΙ Bio-Rad, Hercules, CA dengan kondisi sebagai berikut: tegangan V 2.5 kV, kapasitor C 50 μ F, tahanan R 200 Ω . Koloni hasil transformasi
diseleksi dalam media seleksi YPDS agar zeo Yeast ekstrak pepton dektrosa sorbitol agar, Lampiran 2 yang mengandung 100 μ gml zeocin Invitrogen.
3.2.5 Seleksi P. pastoris transforman
Seleksi sel P. pastoris transforman yang stabil dilakukan dengan cara menumbuhkan ulang koloni transforman yang tumbuh pada medium seleksi ke
dalam medium YPD agar zeo yang baru dengan konsentrasi zeocin 100 µgml. Sel juga ditumbuhkan pada medium YPD agar zeo YPDAzeo dengan konsentrasi
zeocin lebih tinggi 200, 500, dan 1000 µgml untuk memperoleh galur transforman yang mengandung multi salinan gen. Sebagai kontrol digunakan
media YPDA tanpa zeocin. Seleksi dilakukan secara bertahap pada medium YPDAzeo pada cawan petri. Koloni transforman dipilih dan ditotolkan pada
media agar menggunakan tusuk gigi steril. Kemudian cawan petri diinkubasi pada suhu 28-30°C selama 2 hari. Setelah dua hari, dilakukan skoring terhadap koloni
transforman yang tumbuh pada cawan petri tersebut. Transforman yang tumbuh baik pada media YPDA dengan zeocin 100 µgml selanjutnya dipindahkan ke
dalam media dengan konsentrasi zeocin lebih tinggi 200 sampai 1000 µgml.
16
3.2.6 Ekspresi protein pada P. pastoris transforman
Setelah dilakukan proses seleksi, selanjutnya dilakukan uji ekspresi protein rekombinan dari beberapa galur transforman berdasarkan prosedur pada manual
Pichia Expression Kit versi G Invitrogen. Kultur P. pastoris transforman dan
non-transforman nt masing-masing ditumbuhkan pada media agar miring YPDAzeo dan YPDA. Satu ose kultur galur transforman dan galur non-
transforman masing-masing ditumbuhkan dalam 2 ml media YPD cair yang mengandung zeocin atau tanpa zeocin. Kultur diinkubasi pada suhu 30°C dengan
agitasi 250 rpm selama 24 jam. Kultur yang telah tumbuh selanjutnya diinokulasikan ke dalam 25 ml media produksi BMGY 1 ekstrak khamir, 2
pepton, 100 mM dapar potassium fosfat pH 6.0, 1.34 YNB, 4×10
-5
biotin, 1 gliserol, Lampiran 2.
Kultur diinkubasi pada suhu 30°C dengan agitasi 250 rpm selama 24 jam. Setelah 24 jam kultur dipanen, biomasa sel dipisah dari media BMGY dan
dipindahkan ke dalam media induksi BMMY 1 ekstrak khamir, 2 pepton, 100 mM dapar potassium fosfat pH 6.0, 1.34 YNB, 4×10
-5
biotin, 0.5 metanol. Biomassa sel pelet dan media kultur supernatan dipisahkan dengan
cara sentrifugasi 5000 rpm, 15 menit, 4°C. Media kultur disingkirkan sedang biomasa sel diresuspensi dengan 5 ml media BMMY. Suspensi sel dipindahkan
ke dalam 25 ml media BMMY yang baru dengan nilai OD
600
awal = 1. Metanol ditambahkan dengan konsentrasi 0,5 vv ke dalam kultur setiap 24 jam selama
3 hari. Kultur diinkubasi pada suhu 30°C dengan agitasi 250 rpm selama 2 hari. Pengambilan contoh dilakukan setiap 24 jam setelah diinduksi dengan metanol
dan OD
600nm
sel diukur. Kultur sel transforman dipanen dengan cara sentrifugasi 10.000 rpm, 15 menit, suhu 4°C. Biomasa sel disimpan pada suhu –20°C dan
medium kultur bebas sel supernatan disimpan pada suhu 4°C untuk digunakan dalam analisis protein lebih lanjut. Sampel protein dianalisis dengan SDS-PAGE
dan imunobloting slot blot atau western blot.
3.2.7 Pengujian insersi fusi gen pada genom Pichia
Pichia transforman dianalisis dengan teknik PCR koloni untuk mengetahui
insersi fusi gen. Koloni PCR terhadap fusi gen scFv::HPR dilakukan menggunakan 2 reaksi PCR masing-masing menggunakan pasangan primer
VH101FVL101R dan HPR FHPR R. Sedangkan untuk fusi gen scFv::GFP::HPR menggunakan pasangan primer VH101-F dan HPRmut-R. Volume reaksi PCR
adalah 25 µl, terdiri dari 4 µl DNA cetakan, 2× PCR buffer, 75 pmol primer, 1 µl 3G Plant polimerase KAPA, dan dH
2
O. Siklus PCR ditetapkan 40 siklus.
3.2.8 Pengamatan sel dengan mikroskop fluoresen
Sel P. pastoris transforman mengandung gen GFP yang terfusi dengan gen antibody scFv dan gen HPR. Konstruksi fusi gen tersebut terintegrasi ke dalam
DNA genomik pada galur-galur transforman. Pengamatan ekspresi protein rekombinan terhadap sel P. pastoris transforman setelah induksi dengan
