17
methanol, dilakukan menggunakan mikroskop fluoresen Carl Zeiss, Apotome-2 dengan perbesaran 40×. Sel diamati menggunakan filter FITC.
3.2.9 Analisis ekspresi protein rekombinan dengan teknik imunoblotting slot blot dan SDS PAGE
Analisis protein dilakukan terhadap protein ekstraseluler yang dihasilkan. Analisis protein rekombinan dilakukan menggunakan metode slot blot dan SDS-
PAGE. Komposisi gel akrilamid dan larutan dapar SDS PAGE pada Lampiran 4. Supernatan sel kultur dipanen dengan cara disentrifugasi kemudian dipresipitasi
dengan larutan TCA trichloro acetic acid. Sampel protein rekombinan dianalisis menggunakan teknik slot blot. Sampel proein ditransfer ke membran nitroselulosa
melalui proses vaccum. Setelah itu membran diinkubasi dengan 5 susu bebas lemak blocking yang dilarutkan dalam PBS phospate buffered saline-Tween20
selama 1 jam. Kemudian membran dicuci washing dengan PBS-Tween20 selama 5 menit diulang 3 kali. Membran diinkubasi dengan 2 µl antibodi primer
anti-His dalam 10 susu bebas lemak dalam PBS-Tween20 selama 1 jam. Setelah itu, membran dicuci dengan PBS-Tween20 selama 5 menit sebanyak 3
kali. Membran diinkubasi kembali dengan antibodi sekunder anti-mouse IgG dalam 10 susu bebas lemak selama 1 jam. Membran dicuci kembali dengan
PBS-Tween20 selama 5 menit sebanyak 3 kali. Untuk proses deteksi membran diinkubasi dengan larutan staining yang mengandung substrat alkaline peroxidase.
3.2.10 Purifikasi protein rekombinan menggunakan kromatografi kolom afinitas
Sampel protein rekombinan pada medium kultur bebas sel supernatan dipekatkan menggunakan amonium sulfat. Sebanyak 70 ml sampel dipresipitasi
dengan amunium sulfat dengan konsentrasi saturasi 80. Sampel ditempatkan pada labu erlenmeyer, ditambahkan 37,3 gr ammonium sulfat sedikit-demi-sedikit
serta diaduk sampai larut dengan batang pengaduk magnet pada suhu 4°C. Setelah larut seluruhnya, sampel protein diinkubasi selama semalam pada suhu 4°C.
Sampel dipindahkan ke dalam tabung sentrifus dan disentrifugasi 10.000 rpm, 10 menit, 4°C. Supernatan disingkirkan, sedang endapan protein pellet dilarutkan
dengan 1ml dapar fosfat 50mM pH 7,4. Sampel hasil presipitasi 1,5ml didialisis menggunakan tabung dialisis dengan pori 3.500 Da SpectraPor
®
Dialysis Membrane
terhadap dapar fosfat 50mM pH 7,4. Purifikasi dengan kromatografi afinitas dilakukan metode IMAC
immobilized-metal affinity chromatography. Beberapa persiapan dilakukan terhadap matriks dan sampel protein. Persiapan sampel dilakukan dengan
menambahkan dapar pengikat ke dalam sampel hasil dialisis perbandingan 10:1. Komposisi larutan dapar purifikasi terdapat pada Lampiran 4. Untuk persiapan
matriks, sebanyak 250µl resin Ni-NTA Qiagen diequilibrasi dengan dapar pengikat sebanyak 5 kali kolom volume CV. Sampel ditambahkan ke dalam
matriks di dalam tabung tertutup dan diinkubasi selama semalam pada suhu 4°C dengan rotasi. Sampel dan matriks dimasukkan ke dalam kolom purifikasi,
