Bahan Konstruksi dan Ekspresi Protein Fusi anti-EGFRvIII ..scFv::HPRmut ...sebagai kandidat imunotoksin pada Pichia ..pastoris

14

3.2 Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan melalui dua tahap, yaitu : a konstruksi protein fusi, b ekspresi protein fusi pada P. pastoris. Protein fusi dilakukan dengan 2 konstruk, yaitu 1 anti-EGFRvIII scfv dengan HPRmut, 2 anti-EGFRvIII scFv- GFP dengan HPRmut.

3.2.1 Subkloning gen anti-EGFRvIII scFv ke dalam plasmid pPICZαA

Gen scFv anti-EGFR-vIII Weber, 2009 terintegrasi dalam vektor pJ201. Untuk keperluan kloning, gen scFv diamplifikasi dengan teknik PCR dengan dua tahap PCR. Tahap pertama menggunakan primer VH101-F dan VL101-R. Pada tahap kedua, fragmen gen tersebut diamplifikasi kembali menggunakan pasangan primer yang mengandung situs restriksi XhoI yaitu VH-101-F-NdeXho dan VL101-R-NdeXho. Fragmen gen tersebut kemudian dipotong menggunakan enzim XhoI dan dielektroforesis. Selanjutnya gen diisolasi dan dipurifikasi dari gel agarosa. Gen scFv diklon ke vektor ekspresi pPICZα pada situs XhoI tepat setelah sekuen sinyal sekresi faktor-α dan menghasilkan plasmid rekombinan pPICZα-scFv. Selanjutnya plasmid ini dianalisis dan disekuen. Analisis sekuen dilakukan oleh penyedia jasa sekuensing. Satu klon plasmid dengan sekuen yang benar digunakan untuk subkloning berikutnya, yaitu klon pPICZ-scFv no 41 Lampiran 1 dan 2.

3.2.2 Subkloning gen GFP ke dalam plasmid pPICZα-scFv

Gen GFP diisolasi dari plasmid pEGFP-1 Clontech menggunakan teknik PCR dengan dua tahap PCR. Tahap pertama menggunakan pasangan primer EGFP-F dan EGFP-R. Pada tahap kedua, fragmen gen tersebut diamplifikasi kembali menggunakan pasangan primer yang mengandung situs restriksi ClaI yaitu EGFP-F-G4S-ClaI dan EGFP-R-ClaI. Fragmen DNA hasil PCR dipurifikasi dengan kit kolom purifikasi DNA GeneAid. Fragmen gen GFP dan plasmid pPICZα-scFv dipotong dengan enzim ClaI Thermo. Fragmen DNA hasil potong dipurifikasi kembali dengan teknik gel elektroforesis, dan diekstraksi dari gel dengan kit kolom purifikasi DNA dari gel. Gen GFP dan plasmid pPICZα-scFv diligasi dan ditransformasi ke dalam E. coli TOP10 F menurut protokol umum biologi molekuler. E. coli transforman diseleksi pada medium LS-LB Low Salt- Luria Broth , Lampiran 3 agar yang mengandung zeocin 25 µgml. E. coli transforman dianalisis dengan teknik PCR koloni. Klon yang positif mengandung DNA sisipan selanjutnya dianalisis, plasmid rekombinan diekstraksi dan dianalisis urutan nukleotida.

3.2.3 Subkloning gen HPR ke dalam plasmid pPICZα-scFv dan

pPICZα - scFv-GFP Gen HPRmut Leland et al. 2001 terintegrasi dalam pJ912: 72500, dibuat secara sintetik oleh DNA 2.0 Inc. Untuk keperluan kloning, gen HPRmut diisolasi menggunakan teknik PCR dengan dua tahap. Pada tahap pertama menggunakan pasangan primer primer HPRmut-F dan HPRmut-R. Pada tahap kedua fragmen 15 gen tersebut diamplifikasi kembali menggunakan pasangan primer yang mengandung situs restriksi XbaI yaitu HPRmut-F-G4S-Xba dan HPRmut-R-Xba- mod. Amplifikasi menggunakan PCR dilakukan dengan total volume 50 µl, yang mengandung 1 µl DNA cetakan, 20 pmol primer, 0.2 mM dNTPs, 0.4 µl Phire hot start DNA polimerase Thermo, dan dH 2 O. Fragmen gen HPRmut dan plasmid pPIC-scFv-GFP dipotong dengan enzim XbaI Thermo. Fragmen DNA hasil potong dielektroforesis, dipurifikasi dan diekstraksi dari gel dengan kit kolom purifikasi DNA GeneAid. Gen HPRmut dan plasmid pPICZα-scFv-GFP diligasi dan ditransformasi ke dalam E. coli TOP10 F menurut protokol umum biologi molekuler Ausubel, 2002. E. coli transforman diseleksi pada medium LS-LB agar dan zeocin 25 µgml, Lampiran 2. E. coli transforman dianalisis dengan teknik PCR koloni menggunakan pasangan primer AOX1-F dan AOX1-R. Volume reaksi PCR adalah 20 µl, terdiri dari 1 µl DNA cetakan, 20 pmol primer, 0.2 mM dNTPs, 0.5 µl Dream Taq DNA polimerase Thermo, dan dH 2 O. Klon yang positif mengandung DNA sisipan selanjutnya dianalisis untuk menentukan orientasi gen dengan cara PCR menggunakan pasangan primer HPRmut-F dan AOX1-R. Plasmid rekombinan yang diperoleh dianalisis potong menggunakan enzim restriksi XbaI Thermo dan dianalisis urutan nukleotidanya di 1 st Base .

3.2.4 Transformasi P. pastoris dan seleksi sel transforman

Plasmid rekombinan pPICZαA-scFv-GFP-HPR dilinierisasi dengan enzim SacI Thermo. Transformasi pada sel khamir dilakukan dengan teknik elektroporasi dilakukan berdasarkan protokol dari Invitrogen dengan beberapa modifikasi. Sebanyak 0,5 μ g DNA yang telah dilinierisasi dengan enzim SacI dimasukkan ke dalam 60 μ L sel kompeten P. pastoris strain SMD1168H dalam kuvet elektroporasi 2 mm gap, diinkubasi dalam es selama 2 menit. Campuran sel dan DNA dalam kuvet selanjutnya diberi kejut listrik menggunakan Gene Pulser ΙΙ Bio-Rad, Hercules, CA dengan kondisi sebagai berikut: tegangan V 2.5 kV, kapasitor C 50 μ F, tahanan R 200 Ω . Koloni hasil transformasi diseleksi dalam media seleksi YPDS agar zeo Yeast ekstrak pepton dektrosa sorbitol agar, Lampiran 2 yang mengandung 100 μ gml zeocin Invitrogen.

3.2.5 Seleksi P. pastoris transforman

Seleksi sel P. pastoris transforman yang stabil dilakukan dengan cara menumbuhkan ulang koloni transforman yang tumbuh pada medium seleksi ke dalam medium YPD agar zeo yang baru dengan konsentrasi zeocin 100 µgml. Sel juga ditumbuhkan pada medium YPD agar zeo YPDAzeo dengan konsentrasi zeocin lebih tinggi 200, 500, dan 1000 µgml untuk memperoleh galur transforman yang mengandung multi salinan gen. Sebagai kontrol digunakan media YPDA tanpa zeocin. Seleksi dilakukan secara bertahap pada medium YPDAzeo pada cawan petri. Koloni transforman dipilih dan ditotolkan pada media agar menggunakan tusuk gigi steril. Kemudian cawan petri diinkubasi pada suhu 28-30°C selama 2 hari. Setelah dua hari, dilakukan skoring terhadap koloni transforman yang tumbuh pada cawan petri tersebut. Transforman yang tumbuh baik pada media YPDA dengan zeocin 100 µgml selanjutnya dipindahkan ke dalam media dengan konsentrasi zeocin lebih tinggi 200 sampai 1000 µgml.