Latar Belakang Konstruksi dan Ekspresi Protein Fusi anti-EGFRvIII ..scFv::HPRmut ...sebagai kandidat imunotoksin pada Pichia ..pastoris
2
Faktor pertumbuhan epidermal reseptor varian III EGFRvIII adalah varian mutan yang paling umum ditemui dalam sejumlah tumor padat termasuk
glioblastoma GBM, kanker payudara, kanker otak medulloblastoma, dan kanker rahim. EGFR vIII jarang ditemukan pada jaringan normal. Varian reseptor
ini merupakan varian mutan dari EGFR normal yang mengalami delesi ekson-2 sampai ekson-7. Delesi tersebut mengakibatkan sebagian besar domain
ekstraselular hilang dan terbentuknya susunan asam amino yang baru pada ujung –N dari reseptor tersebut. Asam amino glisin terbentuk pada sambungan fusi
antara ekson 1 dan ekson 8. Fusi antara ekson 1 dan 8 serta pembentukan glisin menciptakan antigen baru yang spesifik dari varian mutan EGFR tersebut. Varian
mutan ini dikenal sebagai varian EGFRvIII Gupta et al. 2010.
Terapi kanker terarah selain dapat menggunakan antibodi spesifik tumor juga dapat menggunakan antibodi konyugat yang dikonyugasi dengan senyawa
atau molekul aktif lain yang bersifat sitotoksik, seperti radionuklida Ibritomomomab tiuxetan, Tostitumomab, prodrugs Gemtuzumab ozogamicin,
molekul kecil antikanker doxirubicin, taxol, dsb atau toksin baik berasal dari tanaman, mikroba atau hewan holotoxin, hemitoxin, pseudomonas exotoxin,
diptheria toxin, Onconase Kuan, et al., 2001.
Salah satu strategi alternatif untuk penyampaian obat secara terarah dapat dilakukan dengan dasar imunotosin. Imunotoksin berarti molekul antibodi atau
fragmen antibodi seperti scFv yang difusi atau dikonyugasi dengan suatu molekul toksin. Penelitian mengenai imunoterapi berbasis imunotoksin banyak
dikembangkan saat ini. Salah satunya adalah ‘imunoRNase’ IR yang menggunakan molekul ribonuklease RNase sebagai senyawa aktif toksin
Lorenzo et al. 2004. Salah satu jenis RNase yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah human pancreatic RNase HP-RNase atau HPR. RNase
pada sel normal tidak bersifat sitotoksik, namun akan menjadi toksik ketika memasuki sel target kanker, yaitu sel yang permukaannya menampilkan epitop
yang dikenali oleh bagian dari antibodi Rybak Newton 1999.
HPR merupakan agen terapi yang sangat menjanjikan untuk manusia dibandingkan dengan RNase lain karena bersifat imunogenik yang rendah
sehingga lebih potensial Gaur et al. 2001; Lorenzo et al. 2004; Castro, et al. 2011. Maka dari itu digunakan HPR mutan varian sitotoksik yang terjaga
stabilitas konformasinya serta memiliki aktifitas ribonuklease yang tinggi namun penghambatan oleh RI-nya rendah. Seperti penelitian yang telah dilakukan Gaur
et al.
2001 dan Leland et al. 2001 yang membuat HPR mutan dengan mensubtitusi asam amino pada loop 1 RNase permukaan yang menjaga stabilitas
konformasi dan aktivitas ribonukleolitiknya namun mengurangi penghambatan oleh RI.
Green flouresent protein GFP adalah alat yang ampuh untuk tes berbasis
sel karena floresens intrinsik dari protein ini memungkinkan analisis secara real time dari peristiwa molekuler yang terjadi didalam sel hidup. GFP juga telah
digunakan secara luas untuk mengekspresikan fusi GFP dengan berbagai protein dan sekuen target tertentu. Pada kebanyakan kasus, protein chimera yang
mengkodekan baik fusi N-atau C-terminal ke GFP mempertahankan aktivitas biologis normal dari mitra heterolognya, serta mempertahankan sifat fluoresen
mirip dengan GFP asal Kain, 1999. Maka dari itu GPF yang difusikan dengan scFv dan HPR mutan akan dipakai untuk deteksi protein yang diekspresikan.
3
Pichia pastoris dipilih untuk produksi protein khimera. P. pastoris
merupakan khamir metilotropik yang dapat memproduksi protein dari sel tunggal dan mampu tumbuh dengan kepadatan yang tinggi pada media yang sederhana.
Teknologi fermentasi ini membentuk dasar dari sistem ekspresi yang efisien dengan promoter AOX1 yang diinduksi menggunakan metanol apabila vektornya
terintegrasi ke dalam genom P. pastoris. Keuntungan utama dari penggunaan P. pastoris
adalah menghasilkan protein intraseluler yang sangat tinggi, menghasilkan tingkat sekresi yang tinggi ke media, fermentasinya menghasilkan
kepadatan sel yang tinggi, stabil secara genetik dan menghasilkan protein dalam jumlah yang besar untuk studi analitis Hames Higgins 1999. Peterson et al.
2006 melaporkan bahwa insubilitas scFv dapat diatasi dengan diekspresikan pada khamir metilotropik P. pastoris. Ekspresi berbasis khamir memberikan
pelipatan scFv dan Fab yang tepat dengan level yang tinggi, yang dipulihkan melalui satu langkah kromatografi menggunakan tag afinitas kecil seperti his-
tag. Keuntungan lain dari diekspresikannya scFv dengan sistem ekspresi pada P. pastoris
adalah kemampuannya dalam mengekspresikan protein terapetik pada organisme yang bebas dari virus hewan dan kontaminasi endotoksin sehingga
dapat diaplikasikan tidak hanya untuk obat namun untuk aplikasi bioteknologi lainnya Joosten et al. 2003.
Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengkonstruksi imunoRNase scFv anti-ErbB-2 dan HP-RNase yang semuanya berasal dari manusia dan diuji
secara in vivo dan in vitro. HPR tersebut juga memiliki stabilitas yang tinggi serta sitotoksik yang selektif pada sel target saja Lorenzo et al. 2004. Hal tersebut
didukung oleh penelitian yang dilakukan Borriello et al. 2011 bahwa format scFv-Fc-RNase adalah yang paling sesuai dari produksi generasi baru
immunoRNase untuk aplikasi terapi. Efektivitas immunoRNase ditingkatkan untuk membunuh sel kanker agar lebih efisien, yaitu dengan merekonstruksi
RNase manusia asli dengan varian mutannya agar lebih sitotoksik tahan terhadap RI.