Latar Belakang Konstruksi dan Ekspresi Protein Fusi anti-EGFRvIII ..scFv::HPRmut ...sebagai kandidat imunotoksin pada Pichia ..pastoris

2 Faktor pertumbuhan epidermal reseptor varian III EGFRvIII adalah varian mutan yang paling umum ditemui dalam sejumlah tumor padat termasuk glioblastoma GBM, kanker payudara, kanker otak medulloblastoma, dan kanker rahim. EGFR vIII jarang ditemukan pada jaringan normal. Varian reseptor ini merupakan varian mutan dari EGFR normal yang mengalami delesi ekson-2 sampai ekson-7. Delesi tersebut mengakibatkan sebagian besar domain ekstraselular hilang dan terbentuknya susunan asam amino yang baru pada ujung –N dari reseptor tersebut. Asam amino glisin terbentuk pada sambungan fusi antara ekson 1 dan ekson 8. Fusi antara ekson 1 dan 8 serta pembentukan glisin menciptakan antigen baru yang spesifik dari varian mutan EGFR tersebut. Varian mutan ini dikenal sebagai varian EGFRvIII Gupta et al. 2010. Terapi kanker terarah selain dapat menggunakan antibodi spesifik tumor juga dapat menggunakan antibodi konyugat yang dikonyugasi dengan senyawa atau molekul aktif lain yang bersifat sitotoksik, seperti radionuklida Ibritomomomab tiuxetan, Tostitumomab, prodrugs Gemtuzumab ozogamicin, molekul kecil antikanker doxirubicin, taxol, dsb atau toksin baik berasal dari tanaman, mikroba atau hewan holotoxin, hemitoxin, pseudomonas exotoxin, diptheria toxin, Onconase Kuan, et al., 2001. Salah satu strategi alternatif untuk penyampaian obat secara terarah dapat dilakukan dengan dasar imunotosin. Imunotoksin berarti molekul antibodi atau fragmen antibodi seperti scFv yang difusi atau dikonyugasi dengan suatu molekul toksin. Penelitian mengenai imunoterapi berbasis imunotoksin banyak dikembangkan saat ini. Salah satunya adalah ‘imunoRNase’ IR yang menggunakan molekul ribonuklease RNase sebagai senyawa aktif toksin Lorenzo et al. 2004. Salah satu jenis RNase yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah human pancreatic RNase HP-RNase atau HPR. RNase pada sel normal tidak bersifat sitotoksik, namun akan menjadi toksik ketika memasuki sel target kanker, yaitu sel yang permukaannya menampilkan epitop yang dikenali oleh bagian dari antibodi Rybak Newton 1999. HPR merupakan agen terapi yang sangat menjanjikan untuk manusia dibandingkan dengan RNase lain karena bersifat imunogenik yang rendah sehingga lebih potensial Gaur et al. 2001; Lorenzo et al. 2004; Castro, et al. 2011. Maka dari itu digunakan HPR mutan varian sitotoksik yang terjaga stabilitas konformasinya serta memiliki aktifitas ribonuklease yang tinggi namun penghambatan oleh RI-nya rendah. Seperti penelitian yang telah dilakukan Gaur et al. 2001 dan Leland et al. 2001 yang membuat HPR mutan dengan mensubtitusi asam amino pada loop 1 RNase permukaan yang menjaga stabilitas konformasi dan aktivitas ribonukleolitiknya namun mengurangi penghambatan oleh RI. Green flouresent protein GFP adalah alat yang ampuh untuk tes berbasis sel karena floresens intrinsik dari protein ini memungkinkan analisis secara real time dari peristiwa molekuler yang terjadi didalam sel hidup. GFP juga telah digunakan secara luas untuk mengekspresikan fusi GFP dengan berbagai protein dan sekuen target tertentu. Pada kebanyakan kasus, protein chimera yang mengkodekan baik fusi N-atau C-terminal ke GFP mempertahankan aktivitas biologis normal dari mitra heterolognya, serta mempertahankan sifat fluoresen mirip dengan GFP asal Kain, 1999. Maka dari itu GPF yang difusikan dengan scFv dan HPR mutan akan dipakai untuk deteksi protein yang diekspresikan. 3 Pichia pastoris dipilih untuk produksi protein khimera. P. pastoris merupakan khamir metilotropik yang dapat memproduksi protein dari sel tunggal dan mampu tumbuh dengan kepadatan yang tinggi pada media yang sederhana. Teknologi fermentasi ini membentuk dasar dari sistem ekspresi yang efisien dengan promoter AOX1 yang diinduksi menggunakan metanol apabila vektornya terintegrasi ke dalam genom P. pastoris. Keuntungan utama dari penggunaan P. pastoris adalah menghasilkan protein intraseluler yang sangat tinggi, menghasilkan tingkat sekresi yang tinggi ke media, fermentasinya menghasilkan kepadatan sel yang tinggi, stabil secara genetik dan menghasilkan protein dalam jumlah yang besar untuk studi analitis Hames Higgins 1999. Peterson et al. 2006 melaporkan bahwa insubilitas scFv dapat diatasi dengan diekspresikan pada khamir metilotropik P. pastoris. Ekspresi berbasis khamir memberikan pelipatan scFv dan Fab yang tepat dengan level yang tinggi, yang dipulihkan melalui satu langkah kromatografi menggunakan tag afinitas kecil seperti his- tag. Keuntungan lain dari diekspresikannya scFv dengan sistem ekspresi pada P. pastoris adalah kemampuannya dalam mengekspresikan protein terapetik pada organisme yang bebas dari virus hewan dan kontaminasi endotoksin sehingga dapat diaplikasikan tidak hanya untuk obat namun untuk aplikasi bioteknologi lainnya Joosten et al. 2003. Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengkonstruksi imunoRNase scFv anti-ErbB-2 dan HP-RNase yang semuanya berasal dari manusia dan diuji secara in vivo dan in vitro. HPR tersebut juga memiliki stabilitas yang tinggi serta sitotoksik yang selektif pada sel target saja Lorenzo et al. 2004. Hal tersebut didukung oleh penelitian yang dilakukan Borriello et al. 2011 bahwa format scFv-Fc-RNase adalah yang paling sesuai dari produksi generasi baru immunoRNase untuk aplikasi terapi. Efektivitas immunoRNase ditingkatkan untuk membunuh sel kanker agar lebih efisien, yaitu dengan merekonstruksi RNase manusia asli dengan varian mutannya agar lebih sitotoksik tahan terhadap RI.

1.2. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan mengkonstruksi imunotoksin konjugat dari antibodi untai tunggal scFv anti-EGFRvIII yang difusi dengan varian mutan human pancreatic ribonuclease HPR mutan dengan dan tanpa penanda GFP dan diekspresikan pada P. pastoris. 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Anti EGFR varian III- scFv

Sebuah strategi besar dalam teknologi rekayasa antibodi adalah pembentukan antibodi dari molekul untai tunggal fragmen scFv. Molekul ini dibuat dari penggabungan antara domain VH dan VL dari mAb antibodi monoklonal dengan suatu peptida penghubung fleksibel, yang memungkinkan rekonstitusi dari asosiasi VHVL seperti molekul aslinya Gambar 1. Dengan demikian sebuah fragmen antibodi dapat diproduksi dalam bentuk molekul untai tunggal dan spesifitas antigeniknya tetap dipertahankan. Karena ukurannya yang relatif kecil dibandingkan dengan molekul antibodi utuh, fragmen scFv rekombinan memiliki beberapa sifat menguntungkan seperti kemampuan penetrasi terhadap sel tumor lebih tinggi, waktu tinggal dalam plasma lebih cepat, waktu retensi lebih rendah pada jaringan non-target, dan retensi dari sel tumor lebih rendah. Hal tersebut merupakan fitur yang ideal untuk tujuan radioimunodiagnostik. Selain untuk diagnosis tumor, molekul scFv dapat digunakan untuk pengembangan protein khimera immunotoksin dengan merekayasa domain pengikatan antigen yang difusi dengan suatu agen sitotoksik, seperti senyawa obat anti-kanker, radioisotop, atau protein toksin Binyamin et al. 2006. Gambar 1 Struktur antibodi dan fragmen antibodi yang dapat dimanfaatkan untuk aplikasi terapetik diadopsi dari Peterson et al. 2008 Beberapa faktor pertumbuhan dan reseptornya memiliki peranan penting dalam proses pembelahan, proliferasi dan diferensiasi sel. Kemungkinan untuk mengganggu berlangsungnya proses tersebut menjadikan reseptor faktor pertumbuhan sebagai target terapi yang sangat menarik Kuan et al. 2001. Salah satu molekul reseptor yang sangat menarik untuk dipelajari adalah Epidermal Growth Factor Receptor EGFR. Molekul EGFR ditemukan pada awal tahun 1970-an, merupakan suatu reseptor glikoprotein yang berinteraksi dengan Epidermal Growth Factor EGF maupun Transforming Growth Factor-α TGF- α. Berat molekul EGFR adalah sekitar 170 kDa dan merupakan anggota dari famili reseptor tirosin kinase yang memiliki peran penting dalam pertumbuhan sel kanker, proliferasi sel, angiogenesis, metastasis dan penghambatan apoptosis Pedersen et al. 2005.