Pichia pastoris dan vektor ekspresi pPICZ
10
yang dihasilkan bebas dari kontaminasi, stabil dan memiliki aktivitas biologis Daly Hearn 2005.
Pichia merupakan khamir metilotropik yang sudah lama dipelajari dan
dikembangkan menjadi suatu sistem yang berhasil dalam memproduksi berbagai protein heterolog. Sistem ekspresi P. pastoris sangat populer digunakan karena
beberapa faktor yang menarik seperti : a teknik rekayasa molekuler yang relatif mudah dilakukan dan kesamaan karakteristik dengan Saccharomyces cerevisiae;
b kemampuan P. pastoris untuk memproduksi protein heterolog dengan tinggi secara intraseluler maupun ekstraseluler; c kemampuan melakukan modifikasi
pasca-translasi seperti glikosilasi, pembentukan ikatan disulfida dan proses proteolitik; d tersedianya kit komersial untuk sistem ekspresi Cereghino
Cregg 2000; Balamurugan et al. 2007; Li et al. 2007.
Galur P. pastoris telah terbukti menjadi salah satu sistem yang baik dan
terstandar yang digunakan untuk produksi protein rekombinan secara komersial. Salah satu keuntungan dari sistem ini adalah adanya promotor AOX1. Promoter
ini memiliki karakteristik transkripsi untuk mengatur ekspresi protein heterolog. P. pastoris
telah memiliki metode yang mapan untuk dimanipulasi baik secara klasik maupun melalui rekayasa genetika. P. pastoris telah digunakan untuk
memproduksi protein dalam skala besar dengan kepadatan sel yang tinggi dalam kultur fermentor, sehingga menjadi sistem acuan yang banyak digunakan untuk
tujuan meningkatkan ekspresi protein rekombinan. Sistem ekspresi P. pastoris telah dikenal aman dan murah untuk produksi skala laboratorium dan industri
Balamurugan et al. 2007.
Glikosilasi merupakan salah satu proses penting pascatranslasi dalam sintesis protein. Peran glikosilasi protein diantaranya untuk pelipatan protein,
perakitan oligomer, menjaga stabilitas struktur, transduksi sinyal spesifik, proses pengenalan dan sekresi, dan glikoprotein clearance Li et al. 2007. Glikoprotein
yang dihasilkan dari P. pastoris berpotensi untuk memicu respon imun, namun P. pastoris
dapat mensekresikan protein heterolog yang memiliki pola glikosilasi yang menyerupai manusia humanizing. Pola glikosilasi yang mirip seperti
ukuran dan posisi dari glikosida akan mempengaruhi aktivitas protein. Banyak penelitian terkait glikoprotein yang diproduksi pada P. pastoris yang menjelaskan
hubungan struktur dan fungsi dari N-glikan sehingga akan mempercepat aplikasi terapi pada manusia Patrick et al. 2005.
Galur P. pastoris SMD1168 his4 pep4 merupakan galur defisien protease. Galur ini terbukti efektif dalam meminimalisasi degradasi ekspresi protein
heterolog. Hal ini terlihat pada kultur fermentor yang menghasilkan kombinasi antara densitas sel yang tinggi dan persentase yang rendah dari sel yang lisis
menghasilkan konsentrasi yang relatif tinggi dari protease vakuolar. Pemilihan vektor ekspresi yang resisten terhadap zeocin untuk menghasilkan strain tanpa
aktifitas protease A Invitrogen 2010.
Penggunaan P. pastoris sebagai sistem ekspresi protein rekombinan mempertimbangkan beberapa faktor. Salah satunya yaitu sistem pengekspresi
yang lebih kompleks, dapat mengekspresikan gen tandem, dan dapat digunakan untuk penelitian multi salinan gen. Beberapa aspek seperti faktor genetik dan
fisiologis dari Pichia sehingga digunakan sebagai inang pengekspresi diantaranya penggunaan kodon preferensi dari gen heterolog, jumlah salinan gen, transkripsi
11
yang efisien, sinyal translasi, translokasi yang ditentukan oleh sinyal sekresi, pengolahan dan pelipatan protein dalam retikulum endoplasma dan badan golgi.
P
AOX1
adalah promotor dari gen AOX1 alcohol oxidase 1 yang banyak digunakan. P
AOX1
sangat direpresi dengan keberadaan sumber karbon seperti glukosa, gliserol, etanol dan sebagian besar sumber karbon lainnya, namun dapat
diinduksi secara kuat oleh kehadiran metanol. Alkohol oksidase merupakan enzim pertama dari jalur asimilasi metanol yang mengkatalisis oksidasi terhadap
formaldehida. Pichia memiliki dua gen penyandi alkohol oksidase, yaitu AOX1 dan AOX2. Sekitar 85 dari aktivitas alkohol oksidase diatur oleh gen AOX1,
sedangkan sisanya oleh gen AOX2. Konsentrasi enzim alkohol oksidase bisa mencapai 30 dari protein total sel pada saat tumbuh pada media yang
mengandung metanol Valero 2013.
Vektor ekspresi pPICZα dapat memproduksi protein rekombinan secara ekstraseluler pada P. pastoris dengan tingkat ekspresi yang tinggi Gambar 4.
Vektor ini mengandung beberapa komponen seperti promotor AOX1 5’AOX1, sinyal sekresi factor-, situs restriksi unik, penanda protein protein tag yaitu c-
myc
dan 6xHis, sekuen terminasi transkripsi AOX1 TT, gen resistensi terhadap zeocin, dan sekuen replikasi DNA pada E. coli pUC ori. Promotor AOX1
P
AOX1
dapat diinduksi oleh metanol dan fragmen ini juga merupakan target integrasi plasmid pada lokus promotor AOX1. Sinyal sekresi faktor-α
memungkinkan sekresi protein secara efisien dari Pichia. Situs restriksi yang unik digunakan untuk penyisipan gen ke dalam vektor. Penanda protein c- myc epitope
berfungsi untuk deteksi protein rekombinan. Penanda polihistidin 6xHis berfungsi untuk deteksi dan purifikasi protein rekombinan. AOX1 TT merupakan
sinyal terminasi transkripsi yang memungkinkan prosesing mRNA secara efisien serta poliadenilasi. Promotor TEF1 merupakan promoter gen faktor transkripsi
elongasi 1 berasal dari Saccharomyces cerevisiae yang mendorong ekspresi gen Sh ble
di Pichia untuk resistansi terhadap zeocin. EM7 promoter sintetik untuk prokariot merupakan promotor konstitutif yang mendorong ekspresi gen Sh ble di
E. coli untuk resistansi zeocin.
Gambar 4 Peta vektor pPICZα Invitrogen 2010 Gen Sh ble Streptoalloteichus hindustanus bleomycin merupakan gen resistansi
zeocin. CYC1 TT adalah sekuen terminasi transkripsi dari S. cerevisiae. Sekuen
12
pUC origin memungkinkan replikasi DNA plasmid pada E. coli. Situs restriksi Sac
I, Pme I, atau BstX I merupakan situs restriksi yang unik yang memungkinkan linearisasi dari vektor pada lokus AOX1 agar integrasi plasmid ke dalam genom
Pichia dapat berlangsung secara efisien Invitrogen, 2010.
Pichia telah digunakan secara luas sebagai sel inang untuk produksi protein
rekombinan dalam skala besar. Banyak protein yang penting dalam farmasi berupa suatu glikoprotein mengandung O- atau N-glikosilasi, sehingga
memerlukan sel inang untuk ekspresi protein yang dapat menghasilkan oligosakarida yang terikat pada molekul protein. Jalur N-glikosilasi pada P.
pastoris
dapat direkayasa tanpa mengorbankan kelangsungan hidup sel inang. Hal ini karena sel itu sendiri harus menggunakan N-glikosilasi untuk sintesis dinding
selnya. Pola glikosilasi pada P. pastoris memiliki potensi untuk dimodifikasi melalui rekayasa genetika untuk menghasilkan kompleks N-linked oligosakarida
yang mirip atau identik dengan pola glikosilasi pada protein manusia serta menghasilkan protein dalam jumlah besar sehingga dapat dimanfaatkan bagi
industri farmasi dan penelitian Bretthauer 2003.
3 BAHAN DAN METODE