Pichia pastoris dan vektor ekspresi pPICZ

10 yang dihasilkan bebas dari kontaminasi, stabil dan memiliki aktivitas biologis Daly Hearn 2005. Pichia merupakan khamir metilotropik yang sudah lama dipelajari dan dikembangkan menjadi suatu sistem yang berhasil dalam memproduksi berbagai protein heterolog. Sistem ekspresi P. pastoris sangat populer digunakan karena beberapa faktor yang menarik seperti : a teknik rekayasa molekuler yang relatif mudah dilakukan dan kesamaan karakteristik dengan Saccharomyces cerevisiae; b kemampuan P. pastoris untuk memproduksi protein heterolog dengan tinggi secara intraseluler maupun ekstraseluler; c kemampuan melakukan modifikasi pasca-translasi seperti glikosilasi, pembentukan ikatan disulfida dan proses proteolitik; d tersedianya kit komersial untuk sistem ekspresi Cereghino Cregg 2000; Balamurugan et al. 2007; Li et al. 2007. Galur P. pastoris telah terbukti menjadi salah satu sistem yang baik dan terstandar yang digunakan untuk produksi protein rekombinan secara komersial. Salah satu keuntungan dari sistem ini adalah adanya promotor AOX1. Promoter ini memiliki karakteristik transkripsi untuk mengatur ekspresi protein heterolog. P. pastoris telah memiliki metode yang mapan untuk dimanipulasi baik secara klasik maupun melalui rekayasa genetika. P. pastoris telah digunakan untuk memproduksi protein dalam skala besar dengan kepadatan sel yang tinggi dalam kultur fermentor, sehingga menjadi sistem acuan yang banyak digunakan untuk tujuan meningkatkan ekspresi protein rekombinan. Sistem ekspresi P. pastoris telah dikenal aman dan murah untuk produksi skala laboratorium dan industri Balamurugan et al. 2007. Glikosilasi merupakan salah satu proses penting pascatranslasi dalam sintesis protein. Peran glikosilasi protein diantaranya untuk pelipatan protein, perakitan oligomer, menjaga stabilitas struktur, transduksi sinyal spesifik, proses pengenalan dan sekresi, dan glikoprotein clearance Li et al. 2007. Glikoprotein yang dihasilkan dari P. pastoris berpotensi untuk memicu respon imun, namun P. pastoris dapat mensekresikan protein heterolog yang memiliki pola glikosilasi yang menyerupai manusia humanizing. Pola glikosilasi yang mirip seperti ukuran dan posisi dari glikosida akan mempengaruhi aktivitas protein. Banyak penelitian terkait glikoprotein yang diproduksi pada P. pastoris yang menjelaskan hubungan struktur dan fungsi dari N-glikan sehingga akan mempercepat aplikasi terapi pada manusia Patrick et al. 2005. Galur P. pastoris SMD1168 his4 pep4 merupakan galur defisien protease. Galur ini terbukti efektif dalam meminimalisasi degradasi ekspresi protein heterolog. Hal ini terlihat pada kultur fermentor yang menghasilkan kombinasi antara densitas sel yang tinggi dan persentase yang rendah dari sel yang lisis menghasilkan konsentrasi yang relatif tinggi dari protease vakuolar. Pemilihan vektor ekspresi yang resisten terhadap zeocin untuk menghasilkan strain tanpa aktifitas protease A Invitrogen 2010. Penggunaan P. pastoris sebagai sistem ekspresi protein rekombinan mempertimbangkan beberapa faktor. Salah satunya yaitu sistem pengekspresi yang lebih kompleks, dapat mengekspresikan gen tandem, dan dapat digunakan untuk penelitian multi salinan gen. Beberapa aspek seperti faktor genetik dan fisiologis dari Pichia sehingga digunakan sebagai inang pengekspresi diantaranya penggunaan kodon preferensi dari gen heterolog, jumlah salinan gen, transkripsi 11 yang efisien, sinyal translasi, translokasi yang ditentukan oleh sinyal sekresi, pengolahan dan pelipatan protein dalam retikulum endoplasma dan badan golgi. P AOX1 adalah promotor dari gen AOX1 alcohol oxidase 1 yang banyak digunakan. P AOX1 sangat direpresi dengan keberadaan sumber karbon seperti glukosa, gliserol, etanol dan sebagian besar sumber karbon lainnya, namun dapat diinduksi secara kuat oleh kehadiran metanol. Alkohol oksidase merupakan enzim pertama dari jalur asimilasi metanol yang mengkatalisis oksidasi terhadap formaldehida. Pichia memiliki dua gen penyandi alkohol oksidase, yaitu AOX1 dan AOX2. Sekitar 85 dari aktivitas alkohol oksidase diatur oleh gen AOX1, sedangkan sisanya oleh gen AOX2. Konsentrasi enzim alkohol oksidase bisa mencapai 30 dari protein total sel pada saat tumbuh pada media yang mengandung metanol Valero 2013. Vektor ekspresi pPICZα dapat memproduksi protein rekombinan secara ekstraseluler pada P. pastoris dengan tingkat ekspresi yang tinggi Gambar 4. Vektor ini mengandung beberapa komponen seperti promotor AOX1 5’AOX1, sinyal sekresi factor-, situs restriksi unik, penanda protein protein tag yaitu c- myc dan 6xHis, sekuen terminasi transkripsi AOX1 TT, gen resistensi terhadap zeocin, dan sekuen replikasi DNA pada E. coli pUC ori. Promotor AOX1 P AOX1 dapat diinduksi oleh metanol dan fragmen ini juga merupakan target integrasi plasmid pada lokus promotor AOX1. Sinyal sekresi faktor-α memungkinkan sekresi protein secara efisien dari Pichia. Situs restriksi yang unik digunakan untuk penyisipan gen ke dalam vektor. Penanda protein c- myc epitope berfungsi untuk deteksi protein rekombinan. Penanda polihistidin 6xHis berfungsi untuk deteksi dan purifikasi protein rekombinan. AOX1 TT merupakan sinyal terminasi transkripsi yang memungkinkan prosesing mRNA secara efisien serta poliadenilasi. Promotor TEF1 merupakan promoter gen faktor transkripsi elongasi 1 berasal dari Saccharomyces cerevisiae yang mendorong ekspresi gen Sh ble di Pichia untuk resistansi terhadap zeocin. EM7 promoter sintetik untuk prokariot merupakan promotor konstitutif yang mendorong ekspresi gen Sh ble di E. coli untuk resistansi zeocin. Gambar 4 Peta vektor pPICZα Invitrogen 2010 Gen Sh ble Streptoalloteichus hindustanus bleomycin merupakan gen resistansi zeocin. CYC1 TT adalah sekuen terminasi transkripsi dari S. cerevisiae. Sekuen 12 pUC origin memungkinkan replikasi DNA plasmid pada E. coli. Situs restriksi Sac I, Pme I, atau BstX I merupakan situs restriksi yang unik yang memungkinkan linearisasi dari vektor pada lokus AOX1 agar integrasi plasmid ke dalam genom Pichia dapat berlangsung secara efisien Invitrogen, 2010. Pichia telah digunakan secara luas sebagai sel inang untuk produksi protein rekombinan dalam skala besar. Banyak protein yang penting dalam farmasi berupa suatu glikoprotein mengandung O- atau N-glikosilasi, sehingga memerlukan sel inang untuk ekspresi protein yang dapat menghasilkan oligosakarida yang terikat pada molekul protein. Jalur N-glikosilasi pada P. pastoris dapat direkayasa tanpa mengorbankan kelangsungan hidup sel inang. Hal ini karena sel itu sendiri harus menggunakan N-glikosilasi untuk sintesis dinding selnya. Pola glikosilasi pada P. pastoris memiliki potensi untuk dimodifikasi melalui rekayasa genetika untuk menghasilkan kompleks N-linked oligosakarida yang mirip atau identik dengan pola glikosilasi pada protein manusia serta menghasilkan protein dalam jumlah besar sehingga dapat dimanfaatkan bagi industri farmasi dan penelitian Bretthauer 2003. 3 BAHAN DAN METODE

3.1 Bahan

Mikroorganisme yang digunakan dalam penelitian ini adalah Escherichia coli TOP 10 F’, E.coli DH5α, dan Pichia pastoris SMD 1168H. Plasmid yang digunakan adalah pPICZαA Invitrogen, pJ201-scFv DNA 2.0, pEGFP- 1Clontech. Semua primer DNA yang digunakan dalam penelitian dipesan dari 1 st Base Tabel 2. Gen anti-EGFRvIII scFv dan HPRmut dibuat secara sintetik oleh DNA 2.0. Peta konstruksi plasmid pPICZ-scFv-HPR dan pPICZ-scFv-GFP- HPR disajikan pada Gambar 5. Tabel 2 Primer yang digunakan untuk konstruksi fusi gen dan analisis vektor rekombinan. Nama Primer Oligonukleotida VH101-F 5’ -AAGTTCAATTGGTTGAGTCAGGAG-3’ VL101-R 5’ -TTTGATTTCGACTTTAGTTCCTTGACCA-3’ VH-101-F-NdeXho 5’ -CATATGCTCGAGAAGAGGGAG-3’ VL101-R-NdeXho 5’ -CATATG CTCGAGTCATTAACAATGATG EGFP-F 5’ -CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’ EGFP-R 5’ -ATG GTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’ EGFP-F-G4S-ClaI 5’ -GGGATCGATGGAGGTGGCGGTTCTATGGTG AGCAAGGGCGAGGAG-3’ EGFP-R-Cla 5’ -GGGATCGATCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’ HPRmut-F 5’ - AGTGCTATCCTCCACTGA AGC-3’ HPRmut-R 5’ -AAAGAGTCTTGTGCTAAAAAGTTTCAA-3’ HPRmut-F-G4S-Xba 5’ -GGGTCTAGAGGAGGTGGCGGTTCTAAAGAGTC TTGTGCTAAAAAGTTTCAA-3’ HPRmut-R-Xba-mod 5’ -CTTTCTAGA AGTGCTATCCTCCACTGAAGCCC-3’ AOX1F 5’ -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’ AOX1R 5’ -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’ Gambar 5 Peta konstruksi fusi gen scFv dan HPR di dalam plasmid pPICZα-scFv- HPR A dan pPICZα-scFv-GFP-HPR B. 5AOX1 = promoter alkohol oksidase; α-faktor = sinyal sekresi; scFv = anti-EGFRvIII scFv; GFP = green fluorescent protein gen reporter; HPR = human pancreatic ribonuclease RNase; L= Linker; c-myc = epitop myc; 6xHis = polihistidine tag; STOP = stop kodon; AOX1 TT= sekuen terminator transkripsi. 14

3.2 Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan melalui dua tahap, yaitu : a konstruksi protein fusi, b ekspresi protein fusi pada P. pastoris. Protein fusi dilakukan dengan 2 konstruk, yaitu 1 anti-EGFRvIII scfv dengan HPRmut, 2 anti-EGFRvIII scFv- GFP dengan HPRmut.

3.2.1 Subkloning gen anti-EGFRvIII scFv ke dalam plasmid pPICZαA

Gen scFv anti-EGFR-vIII Weber, 2009 terintegrasi dalam vektor pJ201. Untuk keperluan kloning, gen scFv diamplifikasi dengan teknik PCR dengan dua tahap PCR. Tahap pertama menggunakan primer VH101-F dan VL101-R. Pada tahap kedua, fragmen gen tersebut diamplifikasi kembali menggunakan pasangan primer yang mengandung situs restriksi XhoI yaitu VH-101-F-NdeXho dan VL101-R-NdeXho. Fragmen gen tersebut kemudian dipotong menggunakan enzim XhoI dan dielektroforesis. Selanjutnya gen diisolasi dan dipurifikasi dari gel agarosa. Gen scFv diklon ke vektor ekspresi pPICZα pada situs XhoI tepat setelah sekuen sinyal sekresi faktor-α dan menghasilkan plasmid rekombinan pPICZα-scFv. Selanjutnya plasmid ini dianalisis dan disekuen. Analisis sekuen dilakukan oleh penyedia jasa sekuensing. Satu klon plasmid dengan sekuen yang benar digunakan untuk subkloning berikutnya, yaitu klon pPICZ-scFv no 41 Lampiran 1 dan 2.

3.2.2 Subkloning gen GFP ke dalam plasmid pPICZα-scFv

Gen GFP diisolasi dari plasmid pEGFP-1 Clontech menggunakan teknik PCR dengan dua tahap PCR. Tahap pertama menggunakan pasangan primer EGFP-F dan EGFP-R. Pada tahap kedua, fragmen gen tersebut diamplifikasi kembali menggunakan pasangan primer yang mengandung situs restriksi ClaI yaitu EGFP-F-G4S-ClaI dan EGFP-R-ClaI. Fragmen DNA hasil PCR dipurifikasi dengan kit kolom purifikasi DNA GeneAid. Fragmen gen GFP dan plasmid pPICZα-scFv dipotong dengan enzim ClaI Thermo. Fragmen DNA hasil potong dipurifikasi kembali dengan teknik gel elektroforesis, dan diekstraksi dari gel dengan kit kolom purifikasi DNA dari gel. Gen GFP dan plasmid pPICZα-scFv diligasi dan ditransformasi ke dalam E. coli TOP10 F menurut protokol umum biologi molekuler. E. coli transforman diseleksi pada medium LS-LB Low Salt- Luria Broth , Lampiran 3 agar yang mengandung zeocin 25 µgml. E. coli transforman dianalisis dengan teknik PCR koloni. Klon yang positif mengandung DNA sisipan selanjutnya dianalisis, plasmid rekombinan diekstraksi dan dianalisis urutan nukleotida.

3.2.3 Subkloning gen HPR ke dalam plasmid pPICZα-scFv dan

pPICZα - scFv-GFP Gen HPRmut Leland et al. 2001 terintegrasi dalam pJ912: 72500, dibuat secara sintetik oleh DNA 2.0 Inc. Untuk keperluan kloning, gen HPRmut diisolasi menggunakan teknik PCR dengan dua tahap. Pada tahap pertama menggunakan pasangan primer primer HPRmut-F dan HPRmut-R. Pada tahap kedua fragmen