16
3.2.6 Ekspresi protein pada P. pastoris transforman
Setelah dilakukan proses seleksi, selanjutnya dilakukan uji ekspresi protein rekombinan dari beberapa galur transforman berdasarkan prosedur pada manual
Pichia Expression Kit versi G Invitrogen. Kultur P. pastoris transforman dan
non-transforman nt masing-masing ditumbuhkan pada media agar miring YPDAzeo dan YPDA. Satu ose kultur galur transforman dan galur non-
transforman masing-masing ditumbuhkan dalam 2 ml media YPD cair yang mengandung zeocin atau tanpa zeocin. Kultur diinkubasi pada suhu 30°C dengan
agitasi 250 rpm selama 24 jam. Kultur yang telah tumbuh selanjutnya diinokulasikan ke dalam 25 ml media produksi BMGY 1 ekstrak khamir, 2
pepton, 100 mM dapar potassium fosfat pH 6.0, 1.34 YNB, 4×10
-5
biotin, 1 gliserol, Lampiran 2.
Kultur diinkubasi pada suhu 30°C dengan agitasi 250 rpm selama 24 jam. Setelah 24 jam kultur dipanen, biomasa sel dipisah dari media BMGY dan
dipindahkan ke dalam media induksi BMMY 1 ekstrak khamir, 2 pepton, 100 mM dapar potassium fosfat pH 6.0, 1.34 YNB, 4×10
-5
biotin, 0.5 metanol. Biomassa sel pelet dan media kultur supernatan dipisahkan dengan
cara sentrifugasi 5000 rpm, 15 menit, 4°C. Media kultur disingkirkan sedang biomasa sel diresuspensi dengan 5 ml media BMMY. Suspensi sel dipindahkan
ke dalam 25 ml media BMMY yang baru dengan nilai OD
600
awal = 1. Metanol ditambahkan dengan konsentrasi 0,5 vv ke dalam kultur setiap 24 jam selama
3 hari. Kultur diinkubasi pada suhu 30°C dengan agitasi 250 rpm selama 2 hari. Pengambilan contoh dilakukan setiap 24 jam setelah diinduksi dengan metanol
dan OD
600nm
sel diukur. Kultur sel transforman dipanen dengan cara sentrifugasi 10.000 rpm, 15 menit, suhu 4°C. Biomasa sel disimpan pada suhu –20°C dan
medium kultur bebas sel supernatan disimpan pada suhu 4°C untuk digunakan dalam analisis protein lebih lanjut. Sampel protein dianalisis dengan SDS-PAGE
dan imunobloting slot blot atau western blot.
3.2.7 Pengujian insersi fusi gen pada genom Pichia
Pichia transforman dianalisis dengan teknik PCR koloni untuk mengetahui
insersi fusi gen. Koloni PCR terhadap fusi gen scFv::HPR dilakukan menggunakan 2 reaksi PCR masing-masing menggunakan pasangan primer
VH101FVL101R dan HPR FHPR R. Sedangkan untuk fusi gen scFv::GFP::HPR menggunakan pasangan primer VH101-F dan HPRmut-R. Volume reaksi PCR
adalah 25 µl, terdiri dari 4 µl DNA cetakan, 2× PCR buffer, 75 pmol primer, 1 µl 3G Plant polimerase KAPA, dan dH
2
O. Siklus PCR ditetapkan 40 siklus.
3.2.8 Pengamatan sel dengan mikroskop fluoresen
Sel P. pastoris transforman mengandung gen GFP yang terfusi dengan gen antibody scFv dan gen HPR. Konstruksi fusi gen tersebut terintegrasi ke dalam
DNA genomik pada galur-galur transforman. Pengamatan ekspresi protein rekombinan terhadap sel P. pastoris transforman setelah induksi dengan
Kategori