34
1. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Penentuan panjang gelombang kasein dilakukan dengan menggunakan larutan kasein 1 mgmL yang dilarutkan dalam buffer fosfat pH 8 pada panjang
gelombang antara 650-750 nm. Penentuan ini dilakukan mengacu pada metode Lowry.
Langkah pertama, memasukkan 1 mL larutan kasein 1 mgmL dan 5 mL reagen C ke dalam tabung reaksi dan mengaduknya hingga tercampur sempurna.
Selanjutnya mendiamkan larutan tersebut selama 10 menit, lalu menambahkan 0,5 mL reagen D dan mengocoknya dengan segera. Setelah itu, mendiamkannya
selama 30 menit pada suhu kamar. Terakhir, mengukur absorbansi pada panjang gelombang mulai dari 650 nm sampai 750 nm dengan selang panjang gelombang
10 nm. Panjang gelombang maksimum adalah panjang gelombang yang memberikan nilai absorbansi terbesar. Skema kerja dalam bentuk bagan dapat
dilihat pada Lampiran 1.
2. Penentuan Kondisi Optimum Enzim Tripsin
a. Penentuan pH Optimum
Variasi pH yang digunakan dalam penelitian ini adalah pH 7, 8, dan 9. Penentuan pH optimum enzim tripsin dilakukan mengacu pada metode Anson
Togu G. dan Eddy S., 2012. Prosedur penentuan pH optimum enzim tripsin yaitu:
1. Tabung sampel t
s
Ke dalam 3 tabung reaksi, memasukkan 5 mL larutan substrat kasein 1 dalam berbagai variasi pH pH 7, 8, dan 9. Kemudian melakukan prainkubasi
35
selama 5 menit pada suhu 35°C. Menambahkan 1 mL larutan enzim tripsin dalam berbagai variasi pH pH 7, 8, dan 9 dan 1 mL buffer fosfat 0,1 M dalam berbagai
variasi pH pH 7, 8, dan 9. Setelah itu, melakukan inkubasi selama 20 menit pada suhu 35°C yang dihitung dari penambahan enzim tripsin dan menambahkan 3 mL
larutan TCA 10 kemudian mengaduknya dengan kuat untuk menghentikan reaksi. Selanjutnya mendiamkan larutan selama 20 menit dalam air es agar
endapan yang dihasilkan benar-benar sempurna. Kemudian melakukan sentrifuga dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit pada larutan dan endapan yang
terbentuk, lalu mengambil 2 mL filtrat yang telah disentrifuga dan menambahkan 4 mL NaOH 0,5 M, lalu menambahkan 1 mL reagen Folin-Ciocalteau dan
mendiamkannya selama 10 menit, kemudian mengukur absorbansi pada panjang gelombang maksimum 720 nm.
2. Tabung kontrol t
k
Ke dalam 3 tabung reaksi, memasukkan 1 mL buffer fosfat 0,1 M dalam berbagai variasi pH pH 7, 8, dan 9. Setelah itu, menambahkan 1 mL larutan
tripsin berbagai variasi pH pH 7, 8, dan 9 dan 3 mL larutan TCA 10 dan mengaduknya hingga tercampur. Selanjutnya menambahkan 5 mL larutan substrat
kasein 1 pada berbagai variasi pH pH 7, 8, dan 9 dan mengocoknya hingga homogen. Kemudian menginkubasi selama 5 menit pada suhu 35°C dan
mendiamkannya selama 20 menit dalam air es agar endapan yang dihasilkan benar-benar sempurna. Selanjutnya melakukan sentrifuga dengan kecepatan 3500
rpm selama 15 menit pada larutan dan endapan yang terbentuk. Mengambil 2 mL filtrat yang telah disentrifuga dan menambahkan 4 mL NaOH 0,5 M, lalu
36
menambahkan 1 mL reagen Folin-Ciocalteau dan mendiamkannya selama 10 menit, kemudian mengukur absorbansi pada panjang gelombang maksimum 720
nm. 3.
Tabung blanko Ke dalam 3 tabung reaksi memasukkan 2 mL larutan buffer fosfat 0,1 M
dalam berbagai variasi pH pH 7, 8, dan 9 dan 4 mL NaOH 0,5 M kemudian mengaduknya. Selanjutnya menambahkan 1 mL reagen Folin-Ciocalteau dan
mendiamkannya selama 10 menit, kemudian mengukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 720 nm.
Ringkasan cara kerja penentuan pH optimum enzim tripsin menggunakan tabung sampel, tabung kontrol dan tabung blanko dalam bentuk bagan dapat
dilihat pada Lampiran 2.
b. Penentuan Suhu Optimum
Penentuan suhu optimum enzim tripsin dilakukan mengacu pada metode Anson termodifikasi pada reagen yang digunakan. Prosedur penentuan ini
dilakukan sama dengan prosedur penentuan pH optimum, hanya saja pada penentuan suhu optimum dilakukan pada pH optimum yang telah diperoleh pada
prosedur sebelumnya pH 8 dan dilakukan pada variasi suhu 31°C, 33°C, 35°C, 37°C, dan 39°C. Skema kerja dalam bentuk bagan dapat dilihat pada Lampiran 3.
c. Penentuan Waktu Inkubasi Optimum
Penentuan waktu inkubasi optimum enzim tripsin dilakukan mengacu pada metode Anson termodifikasi pada reagen yang digunakan. Prosedur penentuan ini
37
dilakukan sama dengan prosedur pada penentuan pH optimum, hanya saja penentuan waktu inkubasi optimum dilakukan pada pH dan suhu optimum yang
diperoleh pada prosedur sebelumnya pH 8 dan suhu 37
o
C. Variasi waktu inkubasi yang digunakan, yaitu 10 menit, 15 menit, 20 menit, 25 menit, dan 30
menit. Skema kerja dalam bentuk bagan dapat dilihat pada Lampiran 4.
d. Penentuan Konsentrasi Substrat Optimum
Penentuan konsentrasi substrat optimum dilakukan mengacu pada metode Anson termodifikasi pada reagen yang digunakan. Prosedur penentuan ini
dilakukan sama dengan prosedur pada penentuan pH optimum, hanya saja penentuan konsentrasi substrat optimum dilakukan pada pH, suhu, dan waktu
inkubasi optimum yang diperoleh pada prosedur sebelumnya pH 8, suhu 37
o
C, dan waktu inkubasi selama 20 menit. Variasi konsentrasi substrat yang
digunakan adalah 2 mgmL, 4 mgmL, 6 mgmL, 8 mgmL, 10 mgmL, dan 12 mgmL. Skema kerja dalam bentuk bagan dapat dilihat pada Lampiran 5.
3. Penentuan Aktivitas Enzim Tripsin Pada Kondisi Optimum
Prosedur ini dilakukan mengacu pada metode Anson termodifikasi pada reagen yang digunakan. Prosedur penentuan ini dilakukan sama dengan prosedur
pada penentuan pH, suhu, waktu inkubasi, dan konsentrasi substrat optimum. Penentuan aktivitas enzim tripsin ini dilakukan pada kondisi optimum yang telah
diperoleh pada prosedur sebelumnya pH 8, suhu 37
o
C, waktu inkubasi 20 menit, dan konsentrasi substrat 10 mgmL. Skema kerja dalam bentuk bagan dapat
dilihat pada Lampiran 6.
38
4. Penentuan Aktivitas Enzim Tripsin Dengan Penambahan Ion Logam Cu
2+
dalam Bentuk Senyawa CuCl
2
Penentuan aktivitas enzim tripsin dengan penambahan ion logam Cu
2+
dalam bentuk senyawa CuCl
2
mengacu pada metode Anson termodifikasi pada reagen yang digunakan. Penentuan aktivitas enzim tripsin dengan penambahan ion
logam Cu
2+
dalam bentuk senyawa CuCl
2
dilakukan pada kondisi optimum enzim tripsin yang telah diperoleh pada prosedur sebelumnya pH 8, suhu 37
o
C, waktu inkubasi 20 menit, dan konsentrasi substrat 10 mgmL. Prosedur ini dilakukan
sama dengan prosedur pada penentuan kondisi optimum, hanya saja pada tabung kontrol dan tabung sampel penggunaan 1 mL buffer fosfat 0,1 M pH 8 diganti
dengan penambahan 1 mL larutan ion logam Cu
2+
dalam bentuk senyawa CuCl
2
dalam berbagai variasi konsentrasi. Variasi konsentrasi senyawa CuCl
2
yang ditambahkan, yaitu 0,0010 M; 0,0015 M; 0,0020 M; 0,0025 M; dan 0,0030 M.
Skema kerja dalam bentuk bagan dapat dilihat pada Lampiran 7.
E. Teknik Analisa Data
Data aktivitas enzim tripsin diperoleh dengan mencari selisih serapan antara tabung sampel dengan tabung kontrol per menit. Data aktivitas enzim
tripsin dianalisis secara deskriptif dengan membandingkan aktivitas enzim tripsin tanpa dan dengan penambahan CuCl
2
pada kondisi optimum.
1. Perhitungan Aktivitas Enzim tripsin
Rumus yang digunakan untuk perhitungan aktivitas enzim tripsin yaitu:
� = � − � �
Kategori