55
konsentrasi 8 mgmL 0,00271 mgmL per menit. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Northrop, J. M. 1924, yang menyatakan bahwa
konsentrasi kasein di atas 10 mgmL, yaitu 13,6 mgmL dan 17,5 mgmL memiliki kecepatan hidrolisis kasein yang lebih rendah dibandingkan konsentrasi
kasein 6,8 mgmL dan 8,7 mgmL. Hal tersebut membuktikan bahwa pada konsentrasi substrat 10 mgmL enzim tripsin telah jenuh dengan substrat.
Aktivitas enzim tripsin pada konsentrasi 10 mgmL menunjukkan bahwa semua bagian sisi aktif enzim telah dipenuhi oleh substrat.
4. Penentuan Aktivitas Enzim Tripsin pada Kondisi Optimum
Penentuan aktivitas enzim dilakukan pada kondisi optimum, yaitu pH 8, suhu 37°C, konsentrasi substrat 10 mgmL, dan dengan waktu inkubasi selama 20
menit. Penentuan aktivitas enzim tripsin ditentukan dengan menggunakan metode Anson termodifikasi pada reagen yang digunakan.
Pada prosedur ini menggunakan tiga tabung berbeda, yaitu tabung kontrol t
k
, tabung sampel t
s
, dan tabung blanko. Perbedaan ketiga tabung tersebut terletak pada fungsi masing-masing larutan. Larutan sampel digunakan untuk
menentukan aktivitas enzim tripsin, larutan kontrol digunakan sebagai larutan pembanding, dan larutan blanko yang hanya berisi analit digunakan untuk
mengeliminasi absorbansi yang disebabkan oleh kompleks berwarna tanpa adanya aktivitas enzim tripsin.
Tabung sampel berisi substrat kasein, enzim tripsin, buffer fosfat pH 8, TCA 10, NaOH 0,5 M dan folin-ciocalteu. Tabung kontrol berisi enzim tripsin
yang aktivitasnya telah dihentikan, substrat kasein, buffer fosfat pH 8, TCA 10,
56
NaOH 0,5 M, dan folin-ciocalteu. Sedangkan tabung blanko hanya berisi analit, seperti buffer fosfat pH 8, larutan NaOH 0,5 M, dan reagen folin-ciocalteu.
Dengan adanya larutan blanko, absorbansi yang diukur hanya kompleks yang terbentuk dari reaksi reagen folin-ciocalteu dengan asam amino produk berupa
asam amino hasil aktivitas enzim tripsin dalam menghidrolisis protein. Kasein sebelum digunakan dapat disimpan dalam lemari es pada suhu
rendah. Prainkubasi dilakukan agar ketika substrat kasein bertemu dengan enzim, maka enzim dapat bekerja langsung terhadap substrat tersebut, karena kondisinya
sudah sesuai dengan kondisi optimum enzim tripsin. Penggunaan buffer fosfat 0,1 M pH 8 sebagai larutan penyangga agar pH
larutan yang diuji tetap berada pada pH yang diinginkan optimum. Khusus untuk tabung sampel, campuran enzim tripsin, kasein, dan buffer fosfat pH 8
diinkubasi selama 20 menit pada suhu 37°C. Selama proses inkubasi terjadi reaksi hidrolisis oleh enzim tripsin. Reaksi hidrolisis protein kasein oleh enzim tripsin
sebagai berikut:
Gambar 19. Reaksi Hidrolisis Protein Kasein oleh Enzim Tripsin Setelah diinkubasi selama 20 menit, ditambahkan 3 mL TCA 10 dan
dikocok sampai homogen. Larutan TCA berfungsi untuk menghentikan aktivitas enzim tripsin, sehingga reaksi hidrolisis kasein oleh enzim tripsin dapat terhenti.
Hidrolisi Enzim Tripsin
Polipeptida
57
Larutan TCA bersifat sangat asam dan mampu mengendapkan protein termasuk enzim tripsin dan kasein. Endapan yang terbentuk setelah penambahan TCA,
kemudian dipisahkan dengan cara disentriuga pada kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. Kemudian larutan filtrat yang dihasilkan diambil sebanyak 2 mL dan
dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang selanjutnya ditambahkan reagen lainnya TCA 10, NaOH 0,5 M, dan reagen folin-ciocalteu.
Selanjutnya menyiapkan larutan kontrol yang dibuat dengan prosedur dimana aktivitas enzim tripsin dihentikan terlebih dahulu dengan penambahan
larutan TCA, baru kemudian dipertemukan dengan substrat kasein dan membentuk endapan. Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan melakukan
sentrifuga pada kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. Larutan filtrat yang dihasilkan diambil sebanyak 2 mL dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang
selanjutnya ditambahkan reagen lainnya NaOH 0,5 M dan reagen folin- ciocalteu.
Sedangkan tabung blanko berisi 2 mL buffer fosfat 0,1 M pH 8, dan 4 mL NaOH 0,5 M. Larutan NaOH 0,5 M berfungsi untuk menetralkan suasana
asam dari TCA yang telah ditambahkan. Langkah selanjutnya adalah menambahkan 1 mL reagen Folin-Ciocalteau.
Setelah semua larutan telah ditambahkan reagen folin-ciocalteu, masing- masing larutan ditunggu selama 10 menit untuk diukur absorbansinya
menggunakan spektronik-20 pada panjang gelombang 720 nm. Aktivitas enzim tripsin dapat dilihat dari banyaknya asam amino yang terbentuk dari hidrolisis
58
enzim tripsin. Kemudian diperoleh nilai absorbansi dari hasil hidrolisis protein, yaitu asam amino. Rincian lengkap prosedur ini dapat dilihat pada Lampiran 8.
Pada penentuan aktivitas enzim tripsin digunakan satuan mgmL per menit. Penggunaan satuan tersebut berdasarkan rumus penentuan aktivitas enzim
tripsin, yaitu absorbansi tabung sampel dikurangi absorbansi tabung kontrol dibagi waktu inkubasi menit dengan suhu inkubasi 37°C. Absorbansi tersebut
diperoleh dengan pengukuran sampel menggunakan spektrofotometer. Penggunaan spektrofotometer berdasarkan hukum Lambert-Beer. Menurut
Susila Kristianingrum, dkk 2009: 21, 35, hukum Lambert-Beer:
A = ε . b . C
Keterangan: A = Absorbansi tanpa satuan
b = Tebal kuvet 1 cm ε = Koefisien ekstingsi molar molar
-1
.cm
-1
c = Konsentrasi molar Hukum tersebut menunjukkan bahwa perubahan konsentrasi akan
mengubah absorbansi pada se tiap dengan suatu faktor yang konstan. Dengan
demikian, berdasarkan hukum Lambert-Beer dapat dinyatakan absorbansi A sebanding dengan konsentrasi C dari asam amino yang telah dihidrolisis oleh
enzim tripsin. Semakin besar absorbansi yang diperoleh, maka semakin besar pula konsentrasi asam amino yang terhidrolisis.
Data hasil penentuan aktivitas enzim tripsin pada kondisi optimum dapat dilihat pada Tabel 8. Penentuan aktivitas enzim tripsin dilakukan lima kali
59
pengulangan, karena enzim tripsin dapat dipengaruhi oleh kondisi lingkungannya. Perubahan kondisi dapat mempengaruhi besarnya aktivitas enzim tripsin,
sehingga data aktivitas yang terlihat pada Tabel 8 memiliki nilai absorbansi yang berbeda. Berdasarkan kelima data aktivitas enzim tripsin, dapat diketahui rerata
aktivitas enzim tripsin pada kondisi optimum sebesar 0,00395 mgmL per menit.
5. Penentuan Aktivitas Enzim Tripsin dengan Penambahan Ion Logam Cu
