Kromatografi lapis tipis Kromatografi kolom

1. Kromatografi lapis tipis

Kromatografi lapis tipis KLT merupakan kromatografi planar yang berguna untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Fase diamnya disiapkan dengan melapiskan penjerap ke permukaan lapisan kaca, gelas, atau aluminium. Fase diam untuk KLT biasanya merupakan serbuk yang halus dengan ukuran partikel 10 – 50 μm. Silika, alumina, dan selulosa merupakan fase diam yang paling banyak digunakan. Sampel di totolkan pada lempeng KLT menggunakan mikropipet dan dikembangkandielusikan dengan menempatkan bagian bawah plat KLT dalam pelarut yang cocok. Pelarut akan membasahi plat dengan gaya kapilaritas dan sampel yang ditotolkan pada plat akan bergerak naik dengan kecepatan yang berbeda-beda, bergantung solubilitasnya, dan derajat retensi pada fase diam. Hasil totolan yang telah dielusi harus ditandai dan dapat juga disemprot dengan reagen tertentu agar berwarna. Pada umumnya, totolan akan bergerak mengikuti fase gerak dengan kecepatan yang berbeda dan dapat ditandai dengan nilai Retardation factor Rf. Rf= Christian, 2004. Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu pelarut, suhu, ukuran bejana, dan sifat dari campuran Sastrohamidjojo, 2007. Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Kromatografi lapis tipis menggunakan peralatan yang sederhana dan dapat dikatakan bahwa hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat. Fase gerak dalam KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah campuran dua pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal Gandjar dan Rohman, 2007.

2. Kromatografi kolom

Kromatografi kolom adalah suatu metode pemisahan yang didasarkan pada pemisahan daya adsorbsi suatu adsorben terhadap suatu senyawa. Dimana proses ini sangat tergantung pada eluen yang digunakan jika eluen yang digunakan sudah baik sehingga akan terjadi pemisahan senyawa pada kandungan ekstrak yang sempurna. Dengan menggunakan 3 larutan yang memiliki tingkat kepolaran yang berbeda akan melarutkan beberapa kandungan senyawa yang berbeda yang terkandung pada ekstrak. Gambar 3. Kromatografi Kolom Khopkar, 2003 Dengan menggunakan kolom kromatografi ekstrak yang akan diujikan untuk pemisahan senyawa dimasukkan kedalam kolom yang berisikan silica gel F 254 yang sudah homogen kemudian secara bertahap dengan menggunakan eluen yang berbeda akan mengalirkan senyawa yang terkandung pada ekstrak sehingga akan didapatkan setiap fraksi Gambar3 Khopkar, 2003. Prinsip utama dengan adanya perubahan gradien pada fase gerak adalah untuk meningkatkan kekuatan elusi dari fase gerak, sehingga salah satu senyawa dari analit akan bercampur dengan fase gerak yang sesuai. Metode step – gradient chromatography adalah suatu metode kromatografi dengan perubahan secara langsung antara fase gerak satu dengan fase gerak lainnya yang memiliki kekuatan elusi yang lebih kuat dibandingkan dengan fase gerak sebelumnya Wu, Liang, dan Berthod, 2012. Kelebihan menggunakan gradien fase gerak, yaitu: mengurangi waktu pemisahan, meminimalisir penggunaan pelarut, meningkatkan pemisahan analit, dan memungkinkan sampel yang terelusi memiliki kemurnian yang tinggi Stevens dan Hill, 2009.

H. LANDASAN TEORI