commit to user 38
e. Uji antibakteri Sebanyak 1 gram NA dilarutkan dalam aquades 50 ml dan dipanaskan
sampai kuning bening. Larutan NA kemudian dimasukkan ke dalam botol duran masing-masing sebanyak 15 ml. 100 µl suspensi bakteri diambil lalu taruh dalam
cawan petri yang steril. Ke dalam cawan petri yang berisi suspensi bakteri, kemudian dituangkan media NA steril sebanyak 15 ml dalam suhu tubuh sekitar
30-37ºC tidak terlalu panas dan tidak terlalu dingin, cawan petri digoyangkan sehingga kedua larutan tercampur rata. Campuran tersebut didiamkan sampai
beku ±15 menit. Setelah itu, dibuat lubang dengan ukuran 6 mm dengan alat pervorator dan spatula. Lubang tersebut diisi dengan 20 µl sampel yang telah
dicampur dengan DMSO. Cawan petri dibungkus kembali dengan kertas dan diinkubasi selama 1 hari pada suhu 37ºC.
5. Pemisahan Ekstrak Etanol
Ekstrak etanol kental dilakukan pemisahan dengan menggunakan Kromatografi Vakum Cair KVC. Kolom KVC yang digunakan memiliki
diameter 6 cm. Sebelum melakukan pemisahan dilakukan persiapan kolom KVC dan persiapan sampel. Silika gel F
254
sebanyak 60 gram dimasukkan kedalam kolom kromatografi sampai padat dengan cara ditekan-tekan. Sampel sebanyak 10
gram dicampur dengan silika adsorb sebanyak 10 gram sampai tercampur rata. Apabila sampel dan silika gel F
254
sulit homogen, maka ditambahkan aseton perlahan-lahan sampai kedua bahan tersebut tercampur rata. Setelah homogen,
sampel dibiarkan beberapa saat sampai kering. Sampel ekstrak etanol kering kemudian dimasukkan kedalam kolom
kromatografi yang telah diisi dengan silika gel F
254.
Eluen utuk proses elusi pertama adalah heksana, yang dilanjutkan dengan etil asetat dan terakhir etanol
untuk mendapatkan fraksi heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol. Eluen yang digunakan sebanyak 400 ml heksana, 300 ml etil asetat dan 300 ml etanol.
Pemisahan ekstrak etanol dilakukan 3 kali untuk mendapatkan fraksi-fraksi yang lebih banyak.
commit to user 39
Fraksi heksana, etil asetat dan etanol yang diperoleh kemudian diuapkan pelarutnya dengan penguap vakum putar dengan suhu 40°C hingga diperoleh
fraksi heksana kental, fraksi etil asetat kental dan fraksi etanol kental.
6. Pengujian Aktivitas Antibakteri terhadap Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan
a. Uji aktivitas fraksi-fraksi hasil KVC Fraksi-fraksi yang didapat dilakukan pengujian antibakteri menggunakan
tahapan kerja seperti pada pengujian pada ekstrak etanol untuk mendapatkan fraksi teraktif antibakteri.
b. Penetapan KHM fraksi teraktif antibakteri Penetapan KHM dilakukan untuk mengetahui konsentrasi terendah sampel
uji yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Penetapan KHM dilakukan dengan metode perforasi sama seperti pengujian antibakteri dengan
melakukan variasi konsentrasi sampel. KHM dilakukan terhadap fraksi hasil KVC yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi.
c. Penetapan KHM amoksisilin Konsentrasi Hambat Minimum amoksisilin murni ditetetapkan dengan
cara yang sama dengan penetapan KHM fraksi teraktif antibakteri.
7. Pengujian Golongan Fraksi Teraktif Antibakteri
