3. METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni-Agustus 2008 bertempat di Laboratorium Pengolahan Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Hasil Perairan
Departemen Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Laboratorium Kimia Pangan dan Gizi, Departemen Teknologi Pangan dan Gizi,
Fakultas Teknik Pertanian, Institut Pertaian Bogor, serta Balai Pusat Pasca Panen Bogor.
3.2 Bahan dan Alat Penelitian
Bahan baku yang digunakan adalah kulit ikan kakap merah yang diperoleh dari Muara Baru, Jakarta
. Bahan lain yang digunakan adalah : aquades, asam
asetat teknis 98 yang diperoleh dari toko Setia Guna, dan bahan-bahan yang digunakan untuk pengujian antara lain : Na
2
CO
3
, NaOH, Na
2
S
2
O
3
, HCl, K
2
SO
4,
HgO, H
2
SO
4
, HClO
4
, HNO
3
, air suling, aseton, dan H
3
BO
3
, natrium asetat serta kertas saring whatman 41.
Alat-alat yang digunakan yang digunakan dalam pembuatan dan analisa gelatin kulit ikan kakap merah antara lain wadah tahan asam, pisau, talenan, kain
saring, panci kaca, kompor, pengaduk, timbangan digital, pH meter, gelas ukur, loyang kaca, grinder, termometer, waterbath, oven, gelas piala, sentrifuse, grinder,
botol film, pipet volumetrik, tabung reaksi, erlenmeyer, tabung soxlet, tanur, cawan, desikator, Rheoner RE 3305, Kett Digital Whitenes Powder C-100,
Brookfield Syncro-Lectric Viskometer , magnetic stirrer, atomatic absorption
spectrophotmetri , HPLC Water Assosiates dan kjeltec system.
3.3 Metode Penelitian
Penelitian dilakukan dalam dua tahap, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian pendahuluan adalah pembuatan gelatin dengan proses
lama perendaman asam 12 dan 24 jam serta kombinasi konsentrasi asam 1-5, sedangkan penelitian tahap utama adalah pembuatan gelatin dengan kombinasi
perlakuan konsentratasi dan lama perendaman asam asetat serta analisis sifat fisika kimia produk gelatin yang dihasilkan dibandingkan dengan gelatin
komersial dan gelatin standar laboratorium hasil pengujian Nurilmala 2004.
Pembuatan gelatin dari kulit ikan kakap merah Lutjanus sp. dilakukan dengan metode asam yang dimodifikasi dari Pelu et al. 1998. Tahap utama
proses pembuatan gelatin kulit ikan kakap merah adalah perendaman kulit dalam larutan asam asetat CH
3
COOH, dengan perbandingan kulit ikan kakap merah dan larutan perendaman adalah 1 : 4 serta konsentrasi asam asetat berkisar antara
1-5 vv dengan lama perendaman 12 jam dan 24 jam; dan terakhir adalah ekstraksi dengan suhu 80 ºC ± 3 ºC selama 3 jam dengan ratio banyaknya kulit
ikan dan air aquades adalah 1 : 3.
3.3.1 Penelitian Pendahuluan
Penelitian pendahuluan diawali dengan pembuatan gelatin dari kulit ikan kakap merah Lutjanus sp.. Perlakuan yang diberikan adalah perendaman kulit
ikan kakap merah Lutjanus sp. dalam larutan asam asetat dengan perbandingan kulit ikan dan asam asetat adalah 1 : 4. Konsentrasi asam asetat yang digunakan
adalah 1, 2, 3, 4, dan 5 vv dengan lama perendaman 12 jam dan 24 jam. Kulit ikan kakap merah yang mengalami swellling pengembangan kemudian dicuci
hingga pH netral 5-6. Kemudian dilakukan ekstraksi pada suhu 80 ºC ± 3 ºC selama 3 jam dengan ratio bobot kulit ikan dan aquades adalah 1 : 3. Filtrat yang
diperoleh dari proses ekstraksi selanjutnya disaring dengan menggunakan kain saring, kemudian dikeringkan menggunakan oven pada suhu 50 ºC selama 48 jam
2 hari. Lembaran gelatin yang dihasilkan kemudian digiling dengan menggunakan grinder sehingga didapat gelatin kering berbentuk butiran-butiran
halus tepung gelatin. Selanjutnya untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan dilakukan pengamatan berupa uji fisik yang meliputi rendemen, pH, viskositas,
dan kekuatan gel. Diagram alir proses pembuatan gelatin kulit ikan kakap merah dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Skema proses pembuatan gelatin kulit ikan kakap merah Lutjanus sp.
Modifikasi Pelu et al., 1998
Keterangan : : Masukan input
: Proses : Hasil output
Kulit ikan kakap merah
Penyaringan dengan kain saring Ekstraksi, kulit : akuades = 1 : 3 pada suhu 80 ºC ± 3 ºC, selama 3 jam
Pencucian dengan air hingga pH 5 – 6 Perendaman CH
3
COOH 1, 2, 3 , 4 dan 5 selama 12 jam dan 24 jam Pencucian dengan air mengalir
Pemotongan kulit dengan ukuran 2 x 4 cm Pembersihan dari daging, lemak, sisik, dan kotoran lain
Lembaran gelatin
Uji fisik : rendemen, viskositas dan kekuatan gel
Serbuk gelatin ikan
Pengeringan dengan oven, suhu 50 ºC selama 48 jam
Penghancuranpengecilan ukuran
3.3.2 Penelitian Utama
Penelitian utama adalah pembuatan gelatin dengan konsentrasi dan lama perendaman terpilih dari penelitian pendahuluan, dilanjutkan dengan karakterisasi
gelatin yang meliputi uji fisik yaitu rendemen, pH, viskositas, dan kekuatan gel serta kombinasi perlakuan konsentrasi asam asetat dan lama perendaman kulit
yang efektif untuk menghasilkan gelatin Gambar 5. Hasil terbaik dari penelitian ini dilanjutkan dengan pengujian analisis proksimat kadar air, kadar abu, kadar
protein, dan kadar lemak, serta sifat fisika-kimia gelatin yaitu viskositas, kekuatan gel, derajat keasaman pH, derajat putih, titik isoelektrik protein, titik
gel, titik leleh, kandungan logam berat Pb dan Hg, kandungan asam amino yang dibandingkan dengan gelatin komersial dan gelatin standar laboratorium hasil
pengujian Nurilmala 2004. Hasil terbaik ini juga dilanjutkan dengan pengujian organoleptik warna, penampakan, dan bau yang dibandingkan dengan gelatin
komersial dan standar laboratorium.
3.4 Analisis Fisika dan Kimia Gelatin
Sifat fungsional gelatin sangat penting dalam aplikasi terhadap suatu produk. Sifat tersebut merupakan sifat fisika dan kimia yang mempengaruhi
perilaku gelatin dalam makanan selama proses, penyimpanan, penyiapan, dan pengkonsumsian Kinsela 1982. Sifat fisika gelatin antara lain kekuatan gel, titik
isoelektrik, titik leleh, titik gel, dan derajat putih, sedangkan sifat kimia gelatin antara lain kadar air, kadar abu, kadar lemak, kadar protein, pH, kandungan asam
amino serta kandungan logam berat.
3.4.1 Rendemen AOAC 1995
Rendemen diperoleh dari perbandingan antara berat tepung kering gelatin yang dihasilkan dengan berat bahan segar kulit yang telah dicuci bersih.
Besarnya rendemen dapat diperoleh dengan rumus : Berat bahan kering gelatin
Rendemen 100 = x 100
Berat bahan segar
3.4.2 Kekuatan gel Gaspar 1998
Kekuatan gel dilakukan secara objektif dengan menggunakan alat Rheoner RE 3305. Tingkat kekuatan gel dinyatakan dengan satuan bloom yang berarti
besarnya gaya tekan untuk memecah deformasi produk. Sebelum digunakan alat disetting agar sesuai dengan jenis produk yang akan diukur gelnya karena standar
setting untuk setiap produk berbeda, jarak yang digunakan adalah 400 x 0,01 mm, kecepatan 0,5 mms, sensitifitas 0,2 v dan silinder probe 5 mm. Cara kerja alat ini
yaitu silinder probe 5 mm tidak bergerak, meja tempat untuk meletakkan contoh yang bergerak ke atas mendekati jarum penusuk, tekanan dilakukan sebanyak satu
kali. Hasil pengukuran akan tercetak dalam kertas berbentuk histogram. Pengukuran berdasarkan tingginya histogram.
3.4.3 Viskositas British Standard 757 1975
Larutan gelatin dengan konsentrasi 6,67 bb disiapkan dengan aquades 7 gr gelatin ditambah 105 ml aquades kemudian larutan diukur viskositasnya
dengan menggunakan alat Brookfield Syncro-Lectric Viscometer. Pengukuran dilakukan pada suhu 60 ºC dengan laju geser 60 rpm menggunakan spindel. Hasil
pengukuran dikalikan dengan faktor konversi. Pengujian ini menggunakan spindel no.1 dengan faktor konversinya adalah 1, nilai viskositas dinyatakan dalam satuan
centipoise cP.
3.4.4 Derajat putih Anonim
b
Analisis warna dilakukan dengan menggunakan Kett Digital Whiteness Powder C-100
. Contoh dalam bentuk tepung dimasukan ke dalam cawan contoh, selanjutnya cawan tersebut dimasukkan dalam alat. Nilai dapat langsung dibaca
pada layar dan dinyatakan dalam persentasi derajat putih..
3.4.5 Derajat keasaman pH British Standard 757 1975
Contoh sebanyak 0,2 gr didispersi dalam 20 ml aquades pada suhu 80 ºC. Contoh dihomogenkan dengan magnetic stirer. Kemudian diukur derajat
keasamannya pH pada suhu kamar dengan pH meter.
3.4.6 Kadar air AOAC 1995
Prosedur penentuan kadar air dilakukan dengan cara menimbang 5 gr contoh dan diletakkan dalam cawan kosong yang sudah ditimbang beratnya,
cawan serta tutupnya sebelumnya sudah dikeringkan di dalam oven serta didinginkan di dalam desikator. Cawan yang berisi contoh kemudian ditutup dan
dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 100-102 ºC selama 6 jam. Cawan
tersebut lalu didinginkan di dalam desikator dan setelah dingin cawan ditimbang. Kadar air dapat ditimbang dengan rumus :
W
1
– W
2
Kadar air = x 100 Berat sampel
Keterangan : W
1
= berat sampel + cawan sebelum dikeringkan
W
2
= berat sampel + cawan setelah dikeringkan
3.4.7 Kadar abu AOAC 1995
Prosedur penentuan kadar abu dilakukan dengan cara menimbang sebanyak 5 gr contoh dan dimasukkan ke dalam cawan pengabuan yang telah
ditimbang dan dibakar di dalam tanur dengan suhu 600 ºC serta didinginkan dalam desikator.
Cawan yang berisi contoh dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dan dibakar sampai didapat abu yang berwarna keabu-abuan. Pengabuan ini dilakukan
dalam dua tahap, yaitu pertama pada suhu sekitar 400 ºC selama 1 jam dan kedua pada suhu 550 ºC selama 5 jam. Cawan yang berisi abu tersebut didinginkan
dalam desikator dan kemudian ditimbang. Kadar abu dihitung dengan rumus : Berat abu
Kadar abu = x 100 Berat sampel
3.4.8 Kadar protein AOAC 1995
Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode mikro-kjeldahl. Contoh ditimbang sebanyak 0,2 gr dan dimasukkan ke dalam labu kjeldahl 30 ml.
Kemudian ditambah 2 gr K
2
SO
4
, 50 mg HgO dan 2,5 ml H
2
SO
4
. Contoh didestruksi selama 1-1,5 jam sampai cairan berwarna hijau jernih lalu didinginkan
dan ditambah air suling perlahan-lahan. Isi labu dipindahkan ke dalam alat destilasi, ditambah 10 ml NaOH pekat sampai berwarna coklat kehitaman lalu
didestilasi. Hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer 125 ml yang berisi 5 ml H
3
BO
3
dan dititrasi dengan HCl 0.02N sampai terjadi perubahan warna menjadi merah muda. Perhitungan kadar protein menggunakan rumus :
ml HCl – ml blanko x 14.007 x N HCl N = x 100
mg sampel Protein = N x 6,25
3.4.9 Kadar lemak AOAC 1995
Contoh sebanyak 2 gr ditimbang dan dibungkus dengan kertas saring lalu ditutup dengan kapas bebas lemak dan dimasukkan ke dalam labu lemak. Setelah
itu diletakkan ke dalam alat ekstraksi soxhlet, dengan posisi alat kondensor berada di atas dan labu lemak di bawahnya. Petroleum benzene ditambahkan ke dalam
labu lemak kemudian dilakukan ekstraksi selama ± 6 jam pada suhu 40 °C hingga pelarut yang turun kembali ke labu lemak menjadi jernih. Pelarut yang ada di
dalam labu lemak didestilasi sehingga semua pelarut lemak menguap. Selanjutnya labu lemak hasil ekstraksi dikeringkan dalam oven pada suhu 105 °C. Setelah itu
labu didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Penentuan kadar lemak menggunakan rumus:
berat labu akhir – berat labu awal Kadar lemak = x 100
Berat sampel
3.4.10 Kandungan logam berat Pb dan Hg Hutagalung 1997
Contoh sebanyak 2 gr dimasukkan ke dalam teflon beker dan ditambahkan 1,5 ml HClO
4
dan 3,5 ml HNO
3
, kemudian teflon beker ditutup dan biarkan selama 24 jam. Selanjutnya teflon beker dan contoh dipanaskan di atas penangas
air dengan suhu 60-70 ºC selama ± 2-3 jam sampai larutan jernih bila contoh tidak semua larut, ditambahkan lagi HClO
4
dan 3,5 ml HNO
3
. Kemudian ditambahkan ke dalamnya sebanyak 3 ml air suling bebas ion dan dipanaskan
kembali hingga larutan hampir kering, selanjutnya didinginkan pada suhu ruang. Kemudian ditambahkan 1 ml HNO
3
pekat dan diaduk pelan-pelan. Selanjutnya ditambahkan 9 ml air suling bebas ion, dan dilakukan pengukuran menggunakan
atomic absorption spectrophotometri menggunakan nyala udara esitelin.
3.4.11 Titik leleh Suryaningrum dan Utomo 2002
Larutan gelatin dengan konsentrasi 6,67 bb disiapkan dengan aquades. Contoh diinkubasi pada suhu 10 ºC selama 17 ± 2 jam. Pengukuran titik leleh
dilakukan dengan cara memanaskan gel gelatin dalam waterbath. Diatas gel gelatin tersebut diletakkan gotri dan ketika gotri jatuh ke dasar gel gelatin maka
suhu tersebut merupakan suhu titik leleh.
3.4.12 Titik gel Suryaningrum dan Utomo 2002
Larutan gelatin dengan konsentrasi 6,67 bb disiapkan dengan aquades dan disimpan dalam tabung reaksi yang dihubungkan dengan termometer digital
kemudian diberikan es pada keliling luar bagian tabung reaksi. Titik gel adalah suhu ketika larutan gelatin mulai menjadi gel.
3.4.13 Titik isoelektrik protein Wainewright 1977
Sebanyak 0,2 gr contoh ditambah dengan 40 ml aquades sebagai pelarut dengan kisaran pH 4,5-10,5 interval 0,5. Pengaturan pH dilakukan dengan
menambah NaOH 0,5 N untuk menaikkan pH dan HCl 0,5 N untuk manurunkan pH. Setelah kondisi tercapai dilanjutkan dengan pengadukan selama 30 menit
untuk menyempurnakan reaksi. Larutan yang dihasilkan dipisahkan dengan bagian yang tidak larut dengan cara disentrifuse, kemudian disaring dengan
menggunakan kertas saring whatman 41. Filtrat dianalisis kadar nitrogennya dengan metode mikro-kjeldahl. Kadar nitrogen terlarut yang paling rendah
ditentukan sebagai daerah isoelektrik pl.
3.4.14 Asam amino Muchtadi dkk 1992
Sebanyak 0,2 gr contoh disiapkan dalam tabung reaksi tertutup dan ditambahkan sebanyak 5 ml HCL 6 N. Contoh dimasukkan dalam oven dengan
suhu 100 ºC selama 18-24 jam. Selanjutnya contoh disaring dengan kertas whatman 41. Hasil hidrolisis dipipet sebanyak 10 µl dan dimasukkan ke dalam
tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 30 µl larutan pengering, dan dikeringkan dengan pompa vakum bertekanan 50 torr. Contoh yang telah dikeringkan
ditambah larutan derivat sebanyak 30 µl dan dibiarkan selama ± 20 menit. Contoh selanjutnya diencerkan dengan 200 µl larutan pengencer natrium asetat 1M.
Contoh siap dianalisis dengan menggunakan HPLC Water Associates. Kondisi HPLC pada saat dilakukan analisis :
- Temperatur kolom : 38ºC - Kolom
: pico tag 3,9 x 150 nm coloumb - Kecepatan alir
: Sistem linier gradien - Batas tekanan
: 3000 psi - Program
: gradien - Fase gerak
: - Asetonitril 60 - Buffer Natrium asetat 1 M, pH 5,75
- Detektor : UV, panjang gelombang 254 nm
Konsentrasi asam amino dihitung dengan rumus : Konsentrasi asam amino =
100 x
Bc BsxBMxFp
x As
Ac Keterangan : Ac
= Luas area sampel As
= Luas area standar Bc
= Berat sampel µg Bs
= Berat standar µg BM
= Berat molekul masing-masing asam amino Fp
= Faktor pengenceran 10
3.4.15 Uji organoleptik Soekarto dan Hubeis 1992
Uji organoleptik dilakukan melalui uji segitiga Triangle Test. Sejumlah contoh disajikan bersama dengan pembanding. Kemudian sifat mutu produk yang
meliputi warna, bau, dan penampakan dinilai apakah lebih baik, sama, atau kurang baik. Panelis yang menilai adalah panelis semi terlatih sebanyak 15 orang.
3.5 Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan adalah Racangan Acak Lengkap RAL Faktorial dengan dua taraf yaitu konsentrasi asam asetat dan lama waktu
perendaman dengan 3 kali ulangan. Model rancangan adalah : Y
ij
= µ +
i
+
j
+
ij
+
ij
Dengan i = 1,2,3,... j = 1,2,3,...
Keterangan : Y
ij
= hasil pengamatan µ
= nilai tengah umum A
i
= pengaruh sebenarnya lama perendaman ke-i i = 1,2,3 B
j
= pengaruh sebenarnya konsentrasi pelarut ke-j i = 1,2,3 BA
ij
= pengaruh sebenarnya interaksi antara lama perendaman ke-i i = 1,2,3 dengan konsentrasi pelarut ke-j i = 1,2,3
ij
= faktor galat Jika hasil analisis ragam berbeda nyata maka dilakukan uji lanjut
manggunakan metode Duncan Gaspersz 1994. Rumus uji Duncan : S
y
= KTSr R
p
= qa’ x S
y
Keterangan : S
y
= significant range KTS = jumlah kuadrat sisa
qa’ = significant studentized range Tabel A7. dalam Steel and Torrie 1998
r = ulangan
R
p
= wilayah nyata terkecil
Gambar 5. Skema proses pembuatan gelatin kulit ikan kakap merah Lutjanus sp.
Modifikasi Pelu et al., 1998.
Keterangan : : Masukan input
: Proses : Hasil output
Kulit ikan kakap merah
Penyaringan dengan kain saring Ekstraksi, kulit : akuades = 1 : 3 pada suhu ± 80 ºC, selama 3 jam
Pencucian dengan air hingga pH 5 – 6 Perendaman CH
3
COOH 1, 2, dan 3 selama 12 jam, 18 jam, dan 24 jam Pencucian dengan air mengalir
Pemotongan kulit dengan ukuran 2 x 4 cm Pembersihan dari daging, lemak, sisik, dan kotoran lain
Lembaran gelatin
Uji fisik : rendemen, viskositas, kekuatan gel
Uji kimia : pH, kadar air, abu, protein, lemak, derajat putih, logam berat Pb dan Hg, titik leleh, titik gel, titik isoelektrik
serta asam amino Uji organoleptik : warna, penampakan, bau
Serbuk gelatin ikan
Pengeringan dengan oven, suhu 50 ºC selama 48 jam
Penghancuranpengecilan ukuran
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Penelitian Pendahuluan
Pembuatan gelatin pada tahap penelitian pendahuluan dilakukan dari bahan baku kulit ikan kakap merah Lutjanus sp. dengan menggunakan larutan
asam asetat konsentrasi 1-5 dan dua taraf lama perendaman yaitu 12 jam dan 24 jam. Perlakuan ini dilakukan untuk mengetahui konsentrasi asam asetat dan
lama perendaman yang dapat digunakan untuk menghasilkan gelatin dengan mutu baik.
Parameter uji yang digunakan untuk menentukan karateristik gelatin adalah rendemen, pH, viskositas, dan kekuatan gel. Rendemen merupakan salah
satu parameter yang penting dalam menilai baik tidaknya proses pembuatan gelatin sedangkan kekuatan gel, viskositas, dan pH dipilih sebagai parameter
karena ketiganya merupakan sifat fisika dan kimia yang sangat penting pada aplikasi gelatin pada berbagai produk.
4.1.1 Rendemen gelatin
Rendemen merupakan salah satu parameter yang penting dalam pembuatan gelatin. Rendemen dihitung berdasarkan perbandingan antara gelatin
serbuk yang dihasilkan dengan bobot kulit ikan kakap merah setelah dibersihkan. Hasil rendemen gelatin kulit ikan kakap merah secara lengkap dapat dilihat pada
Gambar 6.
11,72
c
11,7
c
9,13
b
10,34
b
11,75
b
9,85
b
13,33
b
7,21
b
7,78
a
5,32
a
2 4
6 8
10 12
14
1 2
3 4
5 Konsentrasi asam asetat
12 jam 24 jam
Angka-angka yang diikuti huruf berbeda a,b,c menunjukkan berbeda nyata sig0,05
Gambar 6. Histogram rendemen gelatin kulit ikan kakap merah pada penelitian pendahuluan n = 3