Penelitian Pendahuluan Apilkasi Asap Cair Redestilasi untuk Pengawet Nira

3.3.1. Penelitian Pendahuluan

Penelitian pendahuluan mengenai potensi penggunaan asap cair kasar sebagai pengawet nira dilakukan untuk mengevaluasi apakah asap cair kasar dapat diaplikasikan pada pengawetan nira. Penelitian ini diawali dengan uji kontak asap cair tempurung kelapa hasil pengendapan asap cair kasar terhadap kultur campuran mikroorganisme yang diambil langsung dari nira. Konsentrasi asap cair kasar yang digunakan pada pengujian sebesar 0,50, 0,60, 0,80, 1,00, 2,00, dan 3,00vv. Pengujian selanjutnya berupa uji pengawetan nira selama 12 jam penyimpanan dengan penggunaan asap cair kasar sebesar 0,50, 1,00, 2,00, dan 3,00vv. Pengujian dilakukan dengan cara melakukan penyadapan secara langsung menggunakan wadah penampung nira yang telah diberi asap cair kasar dengan volume sedemikian rupa sehingga ketika waktu penyadapan mencapai satu jam diperoleh nira dengan konsentrasi asap cair kasar yang diinginkan tersebut 0,50, 1,00, 2,00, dan 3,00. Setelah satu jam penyadapan dilakukan, nira yang telah mengandung asap cair ini diukur pH-nya dan dicatat sebagai pH pada jam ke-0. Nira kemudian dibawa ke laboratorium menggunakan botol steril dan disegel menggunakan parafilm. Setelah sampai di laboratorium, nira ditampung dalam wadah terbuka pada suhu ruang dan diukur pH-nya setiap jam selama 12 jam. Selain itu, pada konsentrasi yang sama juga dilakukan penyadapan selama 12 jam dan aren hasil penyadapan dibuat menjadi gula.

3.3.2. Redestilasi Asap Cair

Proses destilasi dilakukan dengan pemanasan asap cair secara terus menerus pada suhu 200 C. Uap hasil pemanasan dikondensasi dan kondensat yang dihasilkan ditampung dalam wadah bersih. Hasil destilasi ulang kemudian diukur kadar fenolnya dengan menggunakan metode Slinkard dan Singleton 1977. 33

3.3.2.1. Prosedur Pengukuran Kadar Fenol Slinkard dan Singleton, 1977.

Sebanyak 0.1 ml sampel dimasukkan kedalam labu takar 100 ml. Selanjutnya dimasukkan 75 ml aquades, 5 ml pereaksi follins dan 10 ml NaCO 3 jenuh secara berurutan. Selanjutnya ditambahkan aquades sampai tanda tera, dikocok dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Larutan yang dihasilkan kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 760 nm. Sebagai standar digunakan asam Tannat konsentrasi 0.1 mgml kemudian dipipet 0, 2, 3, 4, 6, dan 8 ml ke dalam labu takar 100 ml yang berbeda, diperlakukan seperti sampel dengan standar sebagai pengganti sampel.

3.3.3. Uji Aktivitas Antimikroba Asap Cair Redestilasi

Uji aktivitas mikroba dilakukan dengan mencari nilai MIC Minimum Inhibitory Concentration asap cair hasil destilasi ulang asap cair redestilasi terhadap bakteri uji. Kultur murni yang digunakan adalah Staphylococcus aureus mewakili bakteri patogen gram positif yang mungkin mengkontaminasi nira akibat higiene penderes yang kurang baik. Pseudomonas aeruginosa mewakili bakteri pembusuk gram negatif, sedangkan bakteri asam laktat BAL yang diisolasi dari nira sebagai bakteri perusak nira dari kelompok gram positif.

3.3.3.1. Prosedur Persiapan Kultur Mikroba

Kultur bakteri Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa dalam agar miring diambil satu ose dan diinokulasikan dalam 10 ml Nutrient Broth NB, kemudian diinkubasikan pada suhu 37 C selama 24 jam. Setelah inkubasi selama 24 jam, bakteri siap digunakan untuk uji kontak. Kultur BAL diperoleh dengan melakukan isolasi langsung dari nira dengan menggunakan metode cawan tuang. Isolasi diawali dengan melakukan plating 1 ml nira pada cawan menggunakan media MRSA yang ditambahi CaCO 3 . Penambahan CaCO 3 dalam media MRSA menyebabkan terbentuknya 34 halo pada wilayah sekitar koloni yang diduga sebagai BAL. Setelah dilakukan plating, cawan dengan agar yang telah memadat diinkubasi terbalik pada suhu 37 C selama 48 jam. Koloni yang terpisah dan memperlihatkan zona halo pada wilayah disekitarnya dipilih untuk diisolasi. Koloni tersebut diambil secara aseptis menggunakan ose dan dimasukkan ke dalam media MRSB dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Kultur yang berusia 24 jam ini di uji pewarnaan Gram dan uji katalase. Kultur yang memberikan warna ungu indikator gram positif dan katalase negatif sudah dapat dijadikan sebagai isolat BAL asal nira.

3.3.3.2. Prosedur Penentuan MIC dengan Metode Kontak Suspension Test

Penentuan MIC dengan metode kontak pada prinsipnya dilakukan dengan cara menumbuhkan mikroorganisme pada media yang sudah ditambah senyawa antimikroba pada konsentrasi tertentu. Satu seri tabung diisi dengan media pertumbuhan. Pada setiap tabung ditambahkan senyawa antimikroba dengan konsentrasi yang berbeda. Selanjutnya pada setiap tabung diinokulasikan mikroorganisme uji dengan jumlah yang sama 10 6 CFUml. Semua seri tabung uji diinkubasikan dengan menggunakan shaker pada suhu ruang selama 24 jam dengan kecepatan 150 rpm. MIC merupakan konsentrasi terendah yang mampu menurunkan jumlah mikroba uji sebesar 90 dari jumlah bakteri kontrol tanpa penambahan asap cair setelah dikontakkan selama 24 jam. Konsentrasi uji untuk S.aureus dan P. aeruginosa secara berturut- turut adalah 0,20 – 0,80vv dan 0,22 - 0,30vv. Konsentrasi ini dirujuk dari Zuraida 2008 yang menggunakan asap cair tanpa destilasi ulang untuk pengawetan bakso ikan. Konsentrasi uji untuk BAL asal nira adalah 0,50 - 30,00vv. Penghitungan nilai MIC ditentukan dengan persen penghambatan dengan rumus : [ ] 100 100 tan x No Nt penghamba − = dimana : Nt = Jumlah mikroba setelah dikontakkan selama 24 jam, dan No = Jumlah mikroba kontrol setelah dikontakkan selama 24 jam 35

3.3.4. Apilkasi Asap Cair Redestilasi untuk Pengawet Nira

Aplikasi asap cair redestilasi dilakukan dengan melakukan suatu simulasi di laboratorium. Simulasi pertama dilakukan untuk menentukan konsentrasi berapa yang akan diujikan pada tahap simulasi penyadapan dengan melihat perubahan nilai pH setelah penyadapan, total mikroba, serta aplikasi langsung dalam pembuatan gula merah. Simulasi kedua dilakukan untuk melihat proses perubahan pH dan perkembangan jumlah mikroba pada nira selama penyadapan. Simulasi pertama dilakukan dengan cara melakukan penyadapan secara langsung menggunakan wadah penampung nira yang telah diberi asap cair dengan volume tertentu. Asap cair yang ditambahkan adalah sebanyak sedemikian rupa sehingga pada waktu penyadapan selama satu jam diperoleh konsentrasi yang diinginkan 2 sampai 10 kali MIC. Setelah satu jam penyadapan dilakukan, nira yang telah mengandung asap cair ini diambil diukur pH-nya dan dicatat sebagai pH pada jam ke- nol. Nira kemudian dibawa ke laboratorium menggunakan botol steril dan disegel menggunakan parafilm. Setelah sampai di laboratorium, nira ditampung dalam wadah terbuka pada suhu ruang. Penghitungan jumlah total mikroba, jumlah bakteri asam laktat, serta jumlah khamir dilakukan dengan cara yang sama pada simulasi pertama. Penghitungan mikroba dilakukan dengan metode BAM 2001. Aplikasi langsung dilakukan dengan menambahkan asap cair kedalam wadah penampung nira yang digunakan untuk menyadap. Nira yang dihasilkan selanjutnya dievaluasi dan diolah menjadi nira. Simulasi kedua adalah simulasi penyadapan. Nira untuk simulasi diperoleh dari nira segar yang disterilisasi pada suhu 121 C selama 15 menit menggunakan autoclave. Wadah penampung yang biasa digunakan petani untuk menyadap diberi asap cair dengan jumlah tertentu. Setiap jam selama 12 jam dilakukan pengisian nira hasil sterilisasi sebanyak 25 ml kedalam 36 wadah penampung berisi asap cair dan diukur perubahan pH-nya baik sebelum diberi tambahan nira maupun sesudahnya. 3.3.4.1. Prosedur Analisis Total Mikroba BAM, 2001 Satu mililiter sampel dipipet dari pengenceran yang dikehendaki ke dalam cawan petri. Sebanyak ± 12-15 ml media dituang ke dalam cawan petri dan segera setelah penuangan agar, cawan petri kemudian digerakkan secara hati-hati untuk menyebarkan sel-sel mikroba secara merata, yaitu dengan gerakkan seperti angka delapan. Setelah agar membeku, cawan di inkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 35 C selama 48 jam. Setelah inkubasi, jumlah koloni yang tumbuh pada cawan dihitung berdasarkan metode Bacteriological Analytical Manual BAM. Proses perhitungan total bakteri dilakukan dengan berbagai ketentuan berdasarkan BAM 2001, antara lain : 1. Cawan yang normal berisi 25-250 koloni. Semua koloni dihitung termasuk titik yang berukuran kecil. Pengenceran dan jumlah koloni semua dicatat untuk setiap cawan. 2. Cawan yang berisi lebih dari 250 koloni dicatat sebagai TBUD Terlalu Banyak Untuk Dihitung. Jika tidak ada koloni yang tumbuh maka ditulis kurang dari 1 kali pengenceran terendah. 3. Rumus perhitungan yang digunakan adalah : Untuk sampel 25-250 koloni : [ ] d n n C N × × + × ∑ = 1 , 1 2 1 dimana : N = Total Bakteri C = Jumlah Total seluruh bakteri n 1 = Jumlah cawan pada pengenceran pertama n 2 = Jumlah cawan pada pengenceran kedua d = Tingkat pengenceran 37

3.3.5. Pembuatan Gula Merah dengan Menggunakan Konsentrasi Asap Cair