3.3.1. Penelitian Pendahuluan
Penelitian pendahuluan mengenai potensi penggunaan asap cair kasar sebagai pengawet nira dilakukan untuk mengevaluasi apakah asap cair kasar
dapat diaplikasikan pada pengawetan nira. Penelitian ini diawali dengan uji kontak asap cair tempurung kelapa hasil pengendapan asap cair kasar
terhadap kultur campuran mikroorganisme yang diambil langsung dari nira. Konsentrasi asap cair kasar yang digunakan pada pengujian sebesar 0,50,
0,60, 0,80, 1,00, 2,00, dan 3,00vv. Pengujian selanjutnya berupa uji pengawetan nira selama 12 jam
penyimpanan dengan penggunaan asap cair kasar sebesar 0,50, 1,00, 2,00, dan 3,00vv. Pengujian dilakukan dengan cara melakukan
penyadapan secara langsung menggunakan wadah penampung nira yang telah diberi asap cair kasar dengan volume sedemikian rupa sehingga ketika waktu
penyadapan mencapai satu jam diperoleh nira dengan konsentrasi asap cair kasar yang diinginkan tersebut 0,50, 1,00, 2,00, dan 3,00. Setelah
satu jam penyadapan dilakukan, nira yang telah mengandung asap cair ini diukur pH-nya dan dicatat sebagai pH pada jam ke-0. Nira kemudian dibawa
ke laboratorium menggunakan botol steril dan disegel menggunakan parafilm. Setelah sampai di laboratorium, nira ditampung dalam wadah terbuka pada
suhu ruang dan diukur pH-nya setiap jam selama 12 jam. Selain itu, pada konsentrasi yang sama juga dilakukan penyadapan selama 12 jam dan aren
hasil penyadapan dibuat menjadi gula.
3.3.2. Redestilasi Asap Cair
Proses destilasi dilakukan dengan pemanasan asap cair secara terus menerus pada suhu 200
C. Uap hasil pemanasan dikondensasi dan kondensat yang dihasilkan ditampung dalam wadah bersih. Hasil destilasi ulang
kemudian diukur kadar fenolnya dengan menggunakan metode Slinkard dan Singleton 1977.
33
3.3.2.1. Prosedur Pengukuran Kadar Fenol Slinkard dan Singleton, 1977.
Sebanyak 0.1 ml sampel dimasukkan kedalam labu takar 100 ml. Selanjutnya dimasukkan 75 ml aquades, 5 ml pereaksi follins dan 10 ml
NaCO
3
jenuh secara berurutan. Selanjutnya ditambahkan aquades sampai tanda tera, dikocok dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Larutan
yang dihasilkan kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 760 nm. Sebagai standar digunakan asam Tannat konsentrasi 0.1 mgml
kemudian dipipet 0, 2, 3, 4, 6, dan 8 ml ke dalam labu takar 100 ml yang berbeda, diperlakukan seperti sampel dengan standar sebagai pengganti
sampel.
3.3.3. Uji Aktivitas Antimikroba Asap Cair Redestilasi
Uji aktivitas mikroba dilakukan dengan mencari nilai MIC Minimum Inhibitory Concentration asap cair hasil destilasi ulang asap cair redestilasi
terhadap bakteri uji. Kultur murni yang digunakan adalah Staphylococcus aureus mewakili bakteri patogen gram positif yang mungkin
mengkontaminasi nira akibat higiene penderes yang kurang baik. Pseudomonas aeruginosa mewakili bakteri pembusuk gram negatif,
sedangkan bakteri asam laktat BAL yang diisolasi dari nira sebagai bakteri perusak nira dari kelompok gram positif.
3.3.3.1. Prosedur Persiapan Kultur Mikroba
Kultur bakteri
Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa dalam agar miring diambil satu ose dan diinokulasikan dalam 10 ml Nutrient
Broth NB, kemudian diinkubasikan pada suhu 37 C selama 24 jam. Setelah
inkubasi selama 24 jam, bakteri siap digunakan untuk uji kontak. Kultur BAL diperoleh dengan melakukan isolasi langsung dari nira
dengan menggunakan metode cawan tuang. Isolasi diawali dengan melakukan plating 1 ml nira pada cawan menggunakan media MRSA yang ditambahi
CaCO
3
. Penambahan CaCO
3
dalam media MRSA menyebabkan terbentuknya
34
halo pada wilayah sekitar koloni yang diduga sebagai BAL. Setelah dilakukan plating, cawan dengan agar yang telah memadat diinkubasi terbalik pada suhu
37 C selama 48 jam. Koloni yang terpisah dan memperlihatkan zona halo
pada wilayah disekitarnya dipilih untuk diisolasi. Koloni tersebut diambil secara aseptis menggunakan ose dan dimasukkan ke dalam media MRSB dan
diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Kultur yang berusia 24 jam ini di
uji pewarnaan Gram dan uji katalase. Kultur yang memberikan warna ungu indikator gram positif dan katalase negatif sudah dapat dijadikan sebagai
isolat BAL asal nira.
3.3.3.2. Prosedur Penentuan MIC dengan Metode Kontak Suspension Test
Penentuan MIC
dengan metode
kontak pada prinsipnya dilakukan dengan cara menumbuhkan mikroorganisme pada media yang sudah ditambah
senyawa antimikroba pada konsentrasi tertentu. Satu seri tabung diisi dengan media pertumbuhan. Pada setiap tabung ditambahkan senyawa antimikroba
dengan konsentrasi yang berbeda. Selanjutnya pada setiap tabung diinokulasikan mikroorganisme uji dengan jumlah yang sama 10
6
CFUml. Semua seri tabung uji diinkubasikan dengan menggunakan shaker pada suhu
ruang selama 24 jam dengan kecepatan 150 rpm. MIC merupakan konsentrasi terendah yang mampu menurunkan jumlah mikroba uji sebesar 90 dari
jumlah bakteri kontrol tanpa penambahan asap cair setelah dikontakkan selama 24 jam.
Konsentrasi uji untuk S.aureus dan P. aeruginosa secara berturut- turut adalah 0,20 – 0,80vv dan 0,22 - 0,30vv. Konsentrasi ini
dirujuk dari Zuraida 2008 yang menggunakan asap cair tanpa destilasi ulang untuk pengawetan bakso ikan. Konsentrasi uji untuk BAL asal nira adalah
0,50 - 30,00vv. Penghitungan nilai MIC ditentukan dengan persen penghambatan dengan rumus :
[ ]
100 100
tan x
No Nt
penghamba −
=
dimana : Nt = Jumlah mikroba setelah dikontakkan selama 24 jam, dan No = Jumlah mikroba kontrol setelah dikontakkan selama 24 jam
35
3.3.4. Apilkasi Asap Cair Redestilasi untuk Pengawet Nira
Aplikasi asap cair redestilasi dilakukan dengan melakukan suatu simulasi di laboratorium. Simulasi pertama dilakukan untuk menentukan
konsentrasi berapa yang akan diujikan pada tahap simulasi penyadapan dengan melihat perubahan nilai pH setelah penyadapan, total mikroba, serta
aplikasi langsung dalam pembuatan gula merah. Simulasi kedua dilakukan untuk melihat proses perubahan pH dan perkembangan jumlah mikroba pada
nira selama penyadapan. Simulasi pertama dilakukan dengan cara melakukan penyadapan
secara langsung menggunakan wadah penampung nira yang telah diberi asap cair dengan volume tertentu. Asap cair yang ditambahkan adalah sebanyak
sedemikian rupa sehingga pada waktu penyadapan selama satu jam diperoleh konsentrasi yang diinginkan 2 sampai 10 kali MIC. Setelah satu jam
penyadapan dilakukan, nira yang telah mengandung asap cair ini diambil diukur pH-nya dan dicatat sebagai pH pada jam ke- nol. Nira kemudian
dibawa ke laboratorium menggunakan botol steril dan disegel menggunakan parafilm. Setelah sampai di laboratorium, nira ditampung dalam wadah
terbuka pada suhu ruang. Penghitungan jumlah total mikroba, jumlah bakteri asam laktat, serta
jumlah khamir dilakukan dengan cara yang sama pada simulasi pertama. Penghitungan mikroba dilakukan dengan metode BAM 2001. Aplikasi
langsung dilakukan dengan menambahkan asap cair kedalam wadah penampung nira yang digunakan untuk menyadap. Nira yang dihasilkan
selanjutnya dievaluasi dan diolah menjadi nira. Simulasi kedua adalah simulasi penyadapan. Nira untuk simulasi
diperoleh dari nira segar yang disterilisasi pada suhu 121 C selama 15 menit
menggunakan autoclave. Wadah penampung yang biasa digunakan petani untuk menyadap diberi asap cair dengan jumlah tertentu. Setiap jam selama
12 jam dilakukan pengisian nira hasil sterilisasi sebanyak 25 ml kedalam
36
wadah penampung berisi asap cair dan diukur perubahan pH-nya baik sebelum diberi tambahan nira maupun sesudahnya.
3.3.4.1. Prosedur Analisis Total Mikroba BAM, 2001 Satu mililiter sampel dipipet dari pengenceran yang dikehendaki ke
dalam cawan petri. Sebanyak ± 12-15 ml media dituang ke dalam cawan petri dan segera setelah penuangan agar, cawan petri kemudian digerakkan secara
hati-hati untuk menyebarkan sel-sel mikroba secara merata, yaitu dengan gerakkan seperti angka delapan. Setelah agar membeku, cawan di inkubasi
dengan posisi terbalik pada suhu 35 C selama 48 jam. Setelah inkubasi,
jumlah koloni yang tumbuh pada cawan dihitung berdasarkan metode Bacteriological Analytical Manual BAM.
Proses perhitungan total bakteri dilakukan dengan berbagai ketentuan berdasarkan BAM 2001, antara lain :
1. Cawan yang normal berisi 25-250 koloni. Semua koloni dihitung termasuk titik yang berukuran kecil. Pengenceran dan jumlah koloni
semua dicatat untuk setiap cawan. 2. Cawan yang berisi lebih dari 250 koloni dicatat sebagai TBUD Terlalu
Banyak Untuk Dihitung. Jika tidak ada koloni yang tumbuh maka ditulis kurang dari 1 kali pengenceran terendah.
3. Rumus perhitungan yang digunakan adalah : Untuk sampel 25-250 koloni :
[ ]
d n
n C
N ×
× +
× ∑
= 1
, 1
2 1
dimana : N
= Total Bakteri C
= Jumlah Total seluruh bakteri n
1
= Jumlah cawan pada pengenceran pertama n
2
= Jumlah cawan pada pengenceran kedua d
= Tingkat pengenceran
37
3.3.5. Pembuatan Gula Merah dengan Menggunakan Konsentrasi Asap Cair