3.3.2.1. Prosedur Pengukuran Kadar Fenol Slinkard dan Singleton, 1977.
Sebanyak 0.1 ml sampel dimasukkan kedalam labu takar 100 ml. Selanjutnya dimasukkan 75 ml aquades, 5 ml pereaksi follins dan 10 ml
NaCO
3
jenuh secara berurutan. Selanjutnya ditambahkan aquades sampai tanda tera, dikocok dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Larutan
yang dihasilkan kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 760 nm. Sebagai standar digunakan asam Tannat konsentrasi 0.1 mgml
kemudian dipipet 0, 2, 3, 4, 6, dan 8 ml ke dalam labu takar 100 ml yang berbeda, diperlakukan seperti sampel dengan standar sebagai pengganti
sampel.
3.3.3. Uji Aktivitas Antimikroba Asap Cair Redestilasi
Uji aktivitas mikroba dilakukan dengan mencari nilai MIC Minimum Inhibitory Concentration asap cair hasil destilasi ulang asap cair redestilasi
terhadap bakteri uji. Kultur murni yang digunakan adalah Staphylococcus aureus mewakili bakteri patogen gram positif yang mungkin
mengkontaminasi nira akibat higiene penderes yang kurang baik. Pseudomonas aeruginosa mewakili bakteri pembusuk gram negatif,
sedangkan bakteri asam laktat BAL yang diisolasi dari nira sebagai bakteri perusak nira dari kelompok gram positif.
3.3.3.1. Prosedur Persiapan Kultur Mikroba
Kultur bakteri
Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa dalam agar miring diambil satu ose dan diinokulasikan dalam 10 ml Nutrient
Broth NB, kemudian diinkubasikan pada suhu 37 C selama 24 jam. Setelah
inkubasi selama 24 jam, bakteri siap digunakan untuk uji kontak. Kultur BAL diperoleh dengan melakukan isolasi langsung dari nira
dengan menggunakan metode cawan tuang. Isolasi diawali dengan melakukan plating 1 ml nira pada cawan menggunakan media MRSA yang ditambahi
CaCO
3
. Penambahan CaCO
3
dalam media MRSA menyebabkan terbentuknya
34
halo pada wilayah sekitar koloni yang diduga sebagai BAL. Setelah dilakukan plating, cawan dengan agar yang telah memadat diinkubasi terbalik pada suhu
37 C selama 48 jam. Koloni yang terpisah dan memperlihatkan zona halo
pada wilayah disekitarnya dipilih untuk diisolasi. Koloni tersebut diambil secara aseptis menggunakan ose dan dimasukkan ke dalam media MRSB dan
diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Kultur yang berusia 24 jam ini di
uji pewarnaan Gram dan uji katalase. Kultur yang memberikan warna ungu indikator gram positif dan katalase negatif sudah dapat dijadikan sebagai
isolat BAL asal nira.
3.3.3.2. Prosedur Penentuan MIC dengan Metode Kontak Suspension Test
Penentuan MIC
dengan metode
kontak pada prinsipnya dilakukan dengan cara menumbuhkan mikroorganisme pada media yang sudah ditambah
senyawa antimikroba pada konsentrasi tertentu. Satu seri tabung diisi dengan media pertumbuhan. Pada setiap tabung ditambahkan senyawa antimikroba
dengan konsentrasi yang berbeda. Selanjutnya pada setiap tabung diinokulasikan mikroorganisme uji dengan jumlah yang sama 10
6
CFUml. Semua seri tabung uji diinkubasikan dengan menggunakan shaker pada suhu
ruang selama 24 jam dengan kecepatan 150 rpm. MIC merupakan konsentrasi terendah yang mampu menurunkan jumlah mikroba uji sebesar 90 dari
jumlah bakteri kontrol tanpa penambahan asap cair setelah dikontakkan selama 24 jam.
Konsentrasi uji untuk S.aureus dan P. aeruginosa secara berturut- turut adalah 0,20 – 0,80vv dan 0,22 - 0,30vv. Konsentrasi ini
dirujuk dari Zuraida 2008 yang menggunakan asap cair tanpa destilasi ulang untuk pengawetan bakso ikan. Konsentrasi uji untuk BAL asal nira adalah
0,50 - 30,00vv. Penghitungan nilai MIC ditentukan dengan persen penghambatan dengan rumus :
[ ]
100 100
tan x
No Nt
penghamba −
=
dimana : Nt = Jumlah mikroba setelah dikontakkan selama 24 jam, dan No = Jumlah mikroba kontrol setelah dikontakkan selama 24 jam
35
3.3.4. Apilkasi Asap Cair Redestilasi untuk Pengawet Nira