sebanyak 3 ekor hewan uji dari tiap kelompok dilakukan pembedahan baik jantan maupun betina. Sementara hewan uji yang tersisa yakni sebanyak 2 ekor
dipelihara tanpa diberi perlakuan infusa biji Persea americana Mill., selama 14 hari untuk melihat sifat efek toksik reversible atau irreversible, lalu pada hari
ke-15 hewan uji dilakukan pembedahan.
11. Prosedur pemusnahan hewan uji
Sebelum pembedahan, hewan uji dikorbankan dengan cara anastetika overdosis yakni memasukkan tikus kedalam wadah tertutup berisi eter yang
akan diinhalasi oleh tikus. Setelah dibedah, organ yang diinginkan diambil menggunakan pinset dan gunting bedah, kemudian organ dicuci dengan larutan
NaCl 0,9 dan dimasukkan kedalam pot formalin 10 untuk diawetkan. Hewan uji yang telah diambil organnya kemudian dikubur.
12. Pengamatan
a. Penimbangan berat badan hewan uji
Data penimbangan berat badan hewan uji dihitung purata perubahan berat badan tiap kelompok hewan uji pada hari ke-0, 7, 14, 21
dan 28. Data perubahan berat badan hewan uji antar minggu dan kelompok perlakuan dianalisis secara statistik dengan menggunakan
General Linier Model Multivariate.
b. Pengukuran asupan pakan dan minum hewan uji
Hewan uji asupan 30 g setiap harinya dan asupan minum 100 ml setiap harinya. Pengukuran dilakukan dengan cara menimbang sisa pakan
dari wadah pakan hewan uji. Selisih penimbangan berat pakan pada hari
pertama dan kedua dihitung sebagai asupan pakan yang dikonsumsi pada hari pertama, metode yang sama juga dilakukan pada pengukuran asupan
minum setiap harinya selama 28 hari perlakuan.
13. Pembuatan preparat dan pemeriksaan histopatologis
Organ yang telah disimpan dalam larutan formalin 10 dilakukan trimming yakni pemotongan tipis jaringan setebal ±4mm dengan orientasi
sesuai dengan organ yang akan dipotong. Potongan jaringan kemudian dimasukkan dalam embeding cassete lalu dilanjutkan dengan proses dehidrasi
menggunakan tissue processor untuk mengeluarkan kandungan air dalam jaringan organ. Proses dehidrasi ini menggunakan cairan dehidran, seperti
etanol atau isopropil alkohol. Cairan dehidran kemudian dibersihkan dari jaringan menggunakan reagen pembersih, yaitu xilol selama 1 jam, yang
kemudian diganti dengan parafin dengan metode penetrasi ke dalam jaringan selama 2 jam. Setelah melalui proses dehidrasi, jaringan yang berada dalam
embeding cassete dipindahkan ke base mold yang berisi parafin cair. Jaringan
kemudian dipotong menggunakan mikrotom, lalu dilakukan pewarnaan menggunakan hematoksilin-eosin. Setelah jaringan pada preparat diwarnai,
kaca preparat ditutup dengan cover glass Carson, 1990. Preparat yang sudah dibuat, dilakukan pembacaan dan pengamatan untuk mendiagnosis gambaran
histopatologis organ hati. Prosedur ini dilakukan oleh pihak Laboratorium Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah Mada,
Yogyakarta.
